第十二章 细胞增殖与凋亡机制 多细胞生物的体细胞命运有三种：经历细胞周期增生；分化成具有特定功能的细胞；死亡并且从生物体中消失。 第十二章 细胞增殖与凋亡机制 多细胞生物的体细胞命运有三种：经历细胞周期增生；分化成具有特定功能的细胞；死亡并且从生物体中消失。 细胞的上述生物学过程受到严密调控，任何一方失控都能导致机体功能障碍和疾病。 本章介绍细胞增生与凋亡的分子机制。

细胞增生 一、细胞周期概念 细胞周期是指从亲代细胞分裂结束到子代细胞分裂结束所经历的过程。一个细胞周期分四个时期：G1、S、G2、M期。

二、细胞周期中各期的生化特点 G1期：从有丝分裂完成到DNA复制之前这一阶段，又称为复制前期。该期细胞内各种RNA、蛋白质合成增多。同时该期是各种细胞群体之间细胞周期的差异取决于此期。 S期：又称为DNA合成期或复制期。该期细胞内遗传物质从二倍体到四倍体。同时组蛋白的合成也同时进行。

G2期：指DNA合成完成到有丝分裂开始这段时间，又称复制后期。该期DNA合成已终止，但仍然进行着RNA和一定蛋白合成。同时线粒体DNA在此期复制。 M期：又称为有丝分裂期。此期细胞呈球形，染色体在此期凝聚后分开，移向细胞两端，解聚并再形成两个完整的核，最后通过细胞质分裂，结束M期。该期蛋白质合成也显著减少，细胞质内的多核糖体大部分解体。

三、细胞周期中关卡是调控细胞周期位点 细胞周期关卡 此概念最早由Weinert和Hartwell提出，原来指酵母受X线照射后引起DNA损伤，诱导相关基因表达并使细胞周期停滞。 目前用来指对细胞周期转折处染色体物理完整性的监控以及对与某些细胞周期事件起始相关的生化途径的监控，而这些细胞周期事件的起始依赖于另一些细胞周期事件的成功完成。

在一个细胞周期内至少存在四个关卡： G1晚期的关卡：监控G1期细胞大小及环境中是否有生长因子。当细胞生长足够大，并且成功完成DNA复制准备工作，不再依赖生长因子，可通过关卡。 G1-S处关卡：监控DNA是否损伤。 G2-M处关卡：监控DNA是否损伤及DNA是否正确完全复制。 有丝分裂中期关卡：监控姐妹染色体是否稳定地附着在纺锤体上。

四、参与细胞周期调控的相关蛋白 参与细胞周期调控的相关蛋白可以分为以下几类： 1、周期蛋白（cyclin） 2、周期蛋白依赖性激酶（Cdk） 3、周期蛋白-周期蛋白依赖性激酶抑制因子（CKI） 4、RB及E2F-DP1转录因子 5、调节Cdk磷酸化和去磷酸化的蛋白激酶和磷酸酶 6、泛素和使蛋白质泛素化的酶

细胞周期调控蛋白的功能 周期蛋白（cyclin）：目前发现细胞内周期蛋白可分为A、B、D、E等类型。它们在细胞的不同时期内含量是可升或降的。它们在核内的含量主要受以下几个因素调控： 1、生长因子诱导的基因表达； 2、泛素介导的蛋白质降解； 3、蛋白质在核与胞质间的运输； 在周期蛋白结构中都有保守的100多个氨基酸残基的周期蛋白盒，该部位是与周期蛋白依赖性激酶（Cdk）结合部位。

周期蛋白依赖性激酶： 该蛋白是细胞内组成型表达的核内丝-苏氨酸蛋白激酶。单独存在无活性，与相应的周期蛋白结合形成复合物，才能具有活性，磷酸化相应底物蛋白质如：RB蛋白、转录因子、组蛋白、细胞结构蛋白等，通过它们的活性，调控细胞周期进程。 同时，Cdk本身还受蛋白激酶和磷酸酶的催化。周期蛋白与Cdk形成的复合物还受Cdk抑制物（CKI）的抑制。 Cyclin D1、2、3 E、A B、A Cdk4/6 Cdk2 Cdk1 调控G1进程 G1-S转折，S进程 G2-M转折

Cdk抑制物(CKI) CKI有两类 1、 Cdk4和Cdk6抑制因子家族，该家族包括P15、P16、P18和P19蛋白。它们主要特异认别和结合Cdk4和Cdk6，抑制周期蛋白D与Cdk4和Cdk6结合，并且能和周期蛋白D- Cdk4/6复合物结合，抑制其对底物蛋白的磷酸化。 2、细胞因子诱导的蛋白/激酶相互作用蛋白（Cip/Kip）家族，包括P21、P27和P57蛋白，是细胞接收到接触抑制、DNA损伤、低氧及一些细胞因子等信号后的产物，主要功能是和周期蛋白- Cdk复合物结合，抑制其活性，但也有一定正调节作用。

RB蛋白与转录因子E2F-DP1的结合 对G1期进展产生负调节 RB家族目前发现三个成员，RB（P105）、P107和P130。它们的分子中有一口袋结构，故称口袋蛋白。 RB蛋白可以和多种蛋白如转录因子E2F-DP1、RNA聚合酶等结合，调控它们活性。 + D- Cdk4/6 E- Cdk2 Pi-RB +E2F-DP1 Pi-RB- E2F-DP1 Pi-RB- E2F-DP1 Pi Pi Pi G1晚期 G1早期 G1中期 相关靶基因表达

使Cdk磷酸化和去磷酸化的酶（蛋白激酶和磷酸酶）也调节Cdk活性 CAK Weel、Myt1 T14Pi Cdc25 Cdk1 Cdk1-T101Pi Cdk1-T101Pi Cdk1-T101Pi Y15Pi S G2 G2-M关卡 M G1 有活性 无活性 无活性 无活性

泛素-蛋白酶体介导蛋白质降解也调节细胞周期 通过泛素-蛋白酶体介导的蛋白质降解途径的蛋白质主要是一些短命的蛋白质，如周期蛋白、P21、P27、E2F等，通过泛素和这些蛋白质中的赖氨酸残基结合后，泛素在也可以通过泛素自身第48位赖氨酸残基在联结泛素，形成多泛素化蛋白，并被运送到蛋白酶体中降解。

五、调控蛋白协同作用调控细胞周期 （一）、 Cdk4/6和Cdk2的活化是限制点处调控的关键因素 + D- Cdk4/6 E- Cdk2 Pi-RB +E2F-DP1 Pi-RB- E2F-DP1 Pi-RB- E2F-DP1 Pi Pi Pi G1晚期 G1早期 G1中期 相关靶基因表达 相关靶基因的表达使细胞做好DNA复制准备，细胞通过G1-S关卡，DNA复制起始，进入S期。

（二）、 Cdk1活化是G2/M关卡处关键调控因素 CAK Weel、Myt1 T14Pi Cdc25 CyclinB Cdk1 Cdk1-T101Pi Cdk1-T101Pi Cdk1-T101Pi Y15Pi S G2 G2-M关卡 M G1 周期蛋白B在G1后期合成，进入核内与Cdk1结合成复合物，但Cdk1此时被强磷酸化，无活性。在G2-M关卡，Cdc25c磷酸酶被活化，使的Cdk1去磷酸化形成有活性的B-Cdk1-T101Pi复合物，从而磷酸化底物蛋白，如组蛋白1、核纤层蛋白、肌球蛋白等，为染色体分离做好准备，细胞通过关卡。

（三）、APC介导的多泛素化蛋白降解是细胞离开M期进入 G1期的关键因素 M期的周期蛋白A/B-Cdk1作用的底物之一是APC蛋白。APC蛋白磷酸化后才有活性。它能在有丝分裂间染色体分离组装完成后，结合在纺锤体处的APC蛋白被活化，最终导致连接姐妹染色体的蛋白质降解，细胞通过有丝分裂中期关卡。可进入G1。

（四）、DNA损伤关卡与G1、G2期停滞相关 1、G2期细胞内DNA受损或DNA复制不完全时，细胞停滞于G2期。 当DNA复制不完全 或DNA受损 激活至少六种 传感器蛋白并 结合到受损DNA 活化ATM/ATR 磷酸化 关卡激酶2/1 缺乏Cdc25c去 磷酸化的Cdk1 无活性，不能通过G2-M关卡 磷酸化Cdc25c能 结合14-3-3蛋白 并出细胞核进入胞质 磷酸化Cdc25c

2、转录因子P53能使细胞停滞在G1和G2期 P53蛋白磷酸化 活化E-Cdk·2 DNA损伤 + + 促进14-3-3基因表达，促进 磷酸化P53蛋白不能被它的抑制蛋白HDM2结合和降解 + + 促进14-3-3基因表达，促进 Cdc25c停留在胞质，Cdk1 无活性，不能通过G2-M关卡 激活P21基因转录 P21蛋白是Cdk的抑制物， 因此细胞停滞于G1和G2

六、生长因子等细胞外因素通过 信号转导调控细胞周期 细胞周期调控受细胞外的生长因子等外在因素的作用，如：细胞生长环境中营养物质和氧气供应量、各种生长因子及细胞因子等。这些外在因素通过细胞膜上的信号转导对细胞周期调控蛋白的基因表达或生物活性进行调控，从而间接调控细胞周期。本节重点谈生长因子对细胞周期的调控。

（一）、细胞从G0进入细胞周期依赖多种生长因子的协同作用 环境中信号分子缺乏； 环境中生长因子不足； 体外培养的原代细胞分裂一定次数后

除分化细胞和衰老细胞外，其它G0期细胞可经过三个阶段， 第一阶段：获得资格 需要血小板源生长因子 第二阶段：进入 需要血小板源生长因子、表皮生长因子、和胰岛素 第三阶段：进展 胰岛素样生长因子1 在多种生长因子协同作用下，通过各种信号转导途径最终活化周期蛋-Cdk，从而使细胞进入G1期。

（二）、G1期的细胞也需要生长因子促进细胞周期进程 Ras-Raf-MAPK途径 特定生长因子（EGF、IGF） 活化P21、P27基因表达 ERK途径 促进G1期合成的周期蛋白D与Cdk4/6结合并转运至细胞核内 + 最终使细胞通过G1期限制点 促进周期蛋白E和Cdk2的表达 磷酸化RB而释放E2F-DP1 +

第二节 细胞凋亡机制 一、细胞凋亡（apoptosis）的概念 细胞凋亡是机体细胞在正常生理或病理状态下发生的一种自发的程序化死亡过程。 细胞凋亡并不完全等同于程序性细胞死亡。程序性细胞死亡的范畴大于细胞凋亡。

细胞坏死最主要形态区别是细胞肿胀、破裂、内容物外流并导致炎症反应。 二、细胞凋亡的形态学变化 细胞缩小而丧失与周围细胞接触，染色质固缩在核膜附近，细胞骨架崩解，核膜消失，DNA断裂成片段，细胞膜起泡，最终细胞解体成许多由细胞膜包裹的凋亡小体，并被周围健康细胞或吞噬细胞吞噬。 细胞坏死最主要形态区别是细胞肿胀、破裂、内容物外流并导致炎症反应。

正常机体内细胞凋亡发生的情况 （一）、在正常生理状态下： 1、胚胎发育期身体形状塑造； 2、胚胎期中枢神经系统发育； 3、胸腺细胞的凋亡； 4、月经周期中子宫内膜脱落及哺乳期后乳腺萎缩； 5、成体中细胞凋亡 （二）、病理状态下细胞凋亡

细胞凋亡机制 一、美丽线虫凋亡机制模型 底物蛋白降解，包括:细胞调节、细胞信号转导、DNA修复、组织平衡、细胞存活等环节中重要的蛋白， 出现凋亡。 抑制 活化 抑制 Egl-1 Ced9 Ced4 Ced3 底物蛋白水解

二、哺乳动物细胞凋亡机制 抑制 活化 抑制 底物蛋白降解,出现凋亡 Egl-1 Ced9 Ced4 Ced3 凋亡蛋白酶活化 因子1（Apaf1） 胱天蛋白酶家族 （caspase） Bcl-2家族

胱天蛋白酶家族（caspase） 胱天蛋白酶的名称来自该酶的活性中心有催化作用的半胱氨酸残基，能水解底物蛋白中特异部位的天冬氨酸残基羧基侧肽键。 该家族在哺乳动物中至少有14种，此类蛋白通常有酶前体和激活的酶两种类型。 Caspases酶原包含三个结构域：NH2末端结构域（Prodomain）、约20KD的大亚基和约10KD的小亚基。酶原的激活需要在大小亚基和N末端结构域内进行切割，形成具有两个独立活性位点的四聚体，这就是被激活的酶。

胱天蛋白酶家族（caspase） 胱天蛋白酶的名称来自该酶的活性中心有催化作用的半胱氨酸残基，能水解底物蛋白中特异部位的天冬氨酸残基羧基侧肽键。 该家族在哺乳动物中至少有14种，此类蛋白通常有酶前体和激活的酶两种类型。 Caspases酶原包含三个结构域：NH2末端结构域（Prodomain）、约20KD的大亚基和约10KD的小亚基。酶原的激活需要在大小亚基和N末端结构域内进行切割，形成具有两个独立活性位点的四聚体，这就是被激活的酶。

Bcl-2家族 bcl-2是B细胞淋巴瘤/白血病基因的缩写，最初从小鼠B淋巴瘤中分离得到。 哺乳动物细胞中目前发现有15种成员。它们都是约为180个氨基酸残基的蛋白质，分子中都有能介导成员之间相互作用、并与其功能相关的BH区（ Bcl-2 homology region）。 BH区有4种。

根据其成员的功能、 BH区种类和数量可分为三类： 第一类成员有抗凋亡功能，分子中含BH1-4区域；第二类成员是促凋亡成员，分子中缺乏BH4区域；第三类成员也是促凋亡成员，分子中只有BH3区域，其成员位于促凋亡途径的上游。

细胞凋亡的信号转导途径 一、外源性死亡受体途径 TNFα _ FLIP 抵抗细胞凋亡 FasL TRADD DD(deathdomain) 活化巨噬细胞和淋巴细胞 细胞毒性T细胞 TRADD DD(deathdomain) TRAF2 DED (death effector domain) _ BIP NFќB抑制因子-Pi FLIP NFќB 抵抗细胞凋亡

二、内源性线粒体途径 当细胞失去生长因子、激素或者脱离原来生长环境，或由于DNA损伤等因素 Cell survival signal(PDGF、EGF、IGF1、胰岛素) MAPK、Akt 14-3-3 Bad 只含有BH3 Bad Pi 凋亡体 促使Bad停在胞浆 Bax Cytc/ Apaf1/ ATP Bax cytc Bcl-2 caspase9 Cell survival 凋亡效应

凋亡途径的正、负调节 凋亡途径的正调节有caspase8、9前体，通过募集，并自我激活，并通过激活下游的胱天蛋白酶级联放大作用，对细胞的凋亡起促进作用。 凋亡途径的负调节有FLIP蛋白的表达，结构类似于caspase8，对其前体活化起抑制作用。同时Bcl-2家族中抗凋亡成员阻断促凋亡成员的作用。此外细胞浆中还存在抑制caspase的凋亡抑制物（IAP）。 同时细胞凋亡的两条途径间也存在联系，如caspase8活化后，不仅活化下流效应者，还能切割促凋亡因子Bid，截短的Bid有活性，结合在线粒体上，促进Bad-Bax结合，激活内源途径。