青光眼基因定位 CP Pang 香港中文大学 眼科视觉科学系

青光眼 视觉损伤和致盲的常见原因 不可逆性致盲的主要原因（香港，23％） 原发性开角型青光眼（POAG），影响到世界人口的1-2% 视网膜神经节细胞和视神经变性，通常由高眼压引起 视觉损伤和致盲的常见原因 不可逆性致盲的主要原因（香港，23％） 原发性开角型青光眼（POAG），影响到世界人口的1-2% 中国人流行病学统计显示，原发性闭角型青光眼（PACG）高于POAG

青光眼遗传学 单基因决定 多因素: 人、环境和遗传因素的 交互作用 候选基因 多基因 遗传学: 遗传的, 家族的, 先天的, 散在的, 获得的

原发性开角型青光眼 始发 基因 基因位点 儿童/迟发 GLC1A (TIGR/MYOC) 1q24-25 始发 基因 基因位点 儿童/迟发 GLC1A (TIGR/MYOC) 1q24-25 成年,慢性 GLC1B 2cen-q13 成年,慢性 GLC1C 3q21-24 成年 GLC1D 8q23 成年 GLC1E (OPTN) 10p14-15 成年 GLC1F 7q35-36 先天性 GLC3A (CYP1B1) 2p21 先天性 GLC3B 1p36 进展性 PITX2 4q25 PAX6, FOXC1 其他至少附加10个染色体定位: 2, 10, 14, 17, 19…….. 2q33.3-37.3(D2S2188-D2S2178 ) 10p12-13 (D10S1477-D10S601)

香港中文大学，眼科和视觉科学系 青光眼遗传学 当前研究 微排列表达概貌 小梁网 基因图谱和连锁分析 中国和菲律宾POAG家族 复合SNPs的多变性分析 OPTN, MYOC, APOE 患者和家族的补充 表现型-基因型相关性的大规模基因突变筛查 OPTN, MYOC, …….

TIGR/MYOC 基因 ( 1q23-q24 ) start 启动子 (5kb) 外显子 1 (604bp) 外显子 2 (126bp) 外显子 3 (782bp) start 内显子 1 (> 10kb) 内显子 2 (~ 1.5kb) poly A signal At the same time, TIGR/Myocilin gene was identified and subsequently was shown to be the glaucoma gene at the GLC1A locus. The TIGR gene spans 20kb and contains 3 exons which is 604bp,126bp and 782bp, respectively. This gene encodes a 504-amino-acid polypeptide which was known as Myocilin/TIGR protein. Signal peptide L-zipper Olfactomedin (40%) Myosin (25%)

Sheffield et al Nat Genet 1993 GLC1A 基因位点 1q21-q31 高加索谱系: 37 subjects, 22 JOAG Short-tandem-repeat polymorphism markers on Chromosome 1 D1S212: Maximum LOD score 6.5 Recombination fraction θ = .00 8 other markers: LOD >3.0 Sheffield et al Nat Genet 1993

TIGR/MYOC 基因 Dexamethasone induced delayed and progressive cellular and extracellular protein/ glycoprotein in cultured human trabecular meshwork cells. Polansky et al 1991 Cloned the trabecular meshwork induced glucocorticoid response (TIGR) gene using cDNA libraries from 10-day 500nM DEX treated HTM cultures. Nguyen et al 1993 Myocilin, a cytoskeletal protein, expressed in the retina photoreceptor cells and localized in the basal body of photoreceptor connecting cilium, playing role in intracellular traffic and cell motility. Kubota et al Genomics 1997 The cDNA TIGR and MYOC identical

TIGR/MYOC 基因 >30 青光眼相关性基因突变已确认 表达于巩膜，睫状体，小梁网，视网膜；心脏，肺，胰腺 Nguyen et al J Biol Chem 1998 Kubota et al Biochem Biophy Res Commun 1998 表达于巩膜，睫状体，小梁网，视网膜；心脏，肺，胰腺 >30 青光眼相关性基因突变已确认 中国人中新发现的青光眼相关性基因突变: Arg91Stop (271CT), Glu300Lys (898GA; 900GA), Tyr471Cys (1412AG) Pang et al IOVS 2002 1.5-4% POAG 与基因突变相关 Alward et al Science 1997 Fingert et al Hum Mol Genet 1999 Kubota et al Hum Mutation 2000 常染色体为主的突变 K423E 未导致青光眼 Morissette et al Nature Genet 1998

TIGR/MYOC 启动子 2 - 5 kb Regulatory elements: TATA box, CAT box, ERE, GRE, nGRE, PRE, serum RE, shear stress RE, AP-1, AP-2 Nguyen et al J Biol Chem 1998 Kirtein et al Genes Cells 2000 Cultured TM cells, Dexamehtasone induced TIGR/MYOC transcription, but no DEX induced site found in a 2700 nt promoter region 5’ Shepard et al IOVS 2001 Promoter mutations in Japanese Suzuki et al Br J Ophthalmol 2000 Promoter mutations associated with glaucoma severity in 1 patient Colomb et al Clin Genet 2001 TIGR/MYOC -1000G & APOE -219G associated with IOP and IOP-lowering treatment Copin et al Am J Hum Genet 2002 No definite TIGR/MYOC promoter mutation, possible protective SNP 2500 nt 5’ Fan et al 2003

“基因敲除人” Arg46Stop (信号序列后仅余13个氨基酸) Lam et al IOVS 2000 - 77岁的老年女性，患有白内障，未患青光眼 低-正常眼压: 双眼均为11 mm Hg TIGR 并非为正常眼功能所必须 TIGR缺失不引起青光眼 TIGR基因突变如何导致 POAG? 通过产生病理性的TIGR功能

TIGR/MYOC 与青光眼 TIGR-MYOC 基因突变通过获得病理性功能导致青光眼 结构变化导致蛋白-蛋白和蛋白-细胞连接能力的改变 Lam et al IOVS 2000 Kim et al Mol Cell Biol 2001 结构变化导致蛋白-蛋白和蛋白-细胞连接能力的改变 寡聚化，多聚体，攻击性，及过表达导致房水流出阻塞

GLC1E 基因位点 10p15-p14 英格兰谱系: 39 subjects, 16 NTG (IOP<22mmHg) Short-tandem-repeat polymorphism markers on Chromosome 10 LINKAGE progam 2-point linkage MLINK, LINKAGE package D10S1216: Maximum LOD score 10.00 Recombination fraction θ = .00 21 other markers: LOD between 3.77 & 9.7 Locus between D10S585 & D10S1664: 5-11 cM Sarfarazi et al Am J Hum Genet 1998

Optineurin (OPTN) 蛋白 先前被认定为 FIP2 (14.7K-interaction protein), NRP (NEMO-related protein), Huntingtin interacting protein, 转录因子 IIIA, RAB8 (Rab GTPase). 联接 Huntingtin 与 Rab8, 调节 endocytic and secretory transport. 与Golgi (like MYOC)相关, 介导 vesicle trafficking TNF-a 凋亡途径的组成成分之一. 与转录因子 IIIA相关, 参与信号转导途径. Li et al Mol Cell Biol 1998, Schwamborn et al J Biol Chem 2000, Yuan & Neufled Glia 2000, Hattula & Peranen Curr Biol 2000, Tezel et al IOVS 2001 Rezaie et al Science 2002

Optineurin (OPTN) 基因 表达于视网膜，小梁网，非色素睫状上皮，心，脑，胎盘，肝，骨骼肌 出现于人、猪、牛、山羊、绵羊的房水中 致突变: E50K (13.5%), c691_692insAG, R545Q 疾病相关多态性: M98K (13.6% patients vs 2.1% patients) 13.7% POAG 中OPTN 基因突变 Rezaie et al Science 2002

Hong Kong OPTN 突变研究 患者 对照 受试者选择标准 前房角开放 视盘改变 ( 如, 杯 /盘 > 0.5) 无MYOC基因突变 患者 排除继发性原因 ( 如：创伤，葡萄膜炎， 激素性青光眼) 前房角开放 视盘改变 ( 如, 杯 /盘 > 0.5) 视野改变 (Anderson’s 标准) 对照 性别、年龄匹配 眼压 <22mmHg

Optineurin (OPTN) 基因 119个中国患者中发现13个新的序列改变 2 个可能的致病性突变: E103D, H486R 2 个可能的疾病相关多态性影响mRNA 的稳定性: V148V, IVS13+21C>G 1 个可能的疾病相关多态性： IVS7+24G>A (13/119, 10% 患者, vs 5/126, 4% 对照) 无 E50K or M98K 在 2/119 (1.6%) 患者中OPTN突变 Leung et al IOVS 2003

POAG 患者的基因型-表现型相关性 OPTN IVS7+24G>A 表现型变量 野生型 杂合子 A/G G/G (n = 13)   表现型变量 OPTN IVS7+24G>A 杂合子 A/G (n = 13) 野生型 G/G (n = 106) 诊断时年龄 (年) 53.6  16.4 56.0  16.8 诊断时眼压 (mmHg) 27.6  9.5 27.2  8.1 杯/盘 (10) 7.8  0.8 a 6.7  1.4 a 视力 (10) 3.8  2.0 4.1  2.8   a P = 0.005 with Mann-Whitney U test, P = 0.02 with logistic regression analysis.

The Optineurin (OPTN) 基因 Known Protein Domains Adenovirus E3-14.7K ATG RAB8 TFIIIA Huntingtin bZIP LZ ZF-C2H2 Putative Domains: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 5’ UTR 3’ UTR Exon Size: The OPTN gene contains 3 noncoding exons in the 5’ –untranslated regoin (UTR) and 13 coding exons. It codes for a 577-amino acid protein, which is known to interact with adenovirus E3-14.7K, Huntingtin, transcription factor IIIA and RAB8. The protein contains 3 putative domains which are bZIP, LZ and ZF-C2H2. The obseved mutations are mainly located in exons 4, 5, 6, 14 and 16. >78 152 54 26 166 203 183 74 153 103 116 150 94 159 131 80 >122 T34T M98K c.691_692insAG IVS8+20G>A IVS13+21C>G R545Q Observed Mutations: L41L E103D V148V P199P H486R T49T E163E IVS7+24G>A IVS15+10G>A E50K IVS6-10G>A IVS15-48C>A IVS6-5T>C

(1.5% in Chinese, Pang et al 2002 ) (3% in Chinese, Leung et al 2003) POAG的遗传学检测 可获得的TIGR-MYOC 1.5-4% 准确性 (1.5% in Chinese, Pang et al 2002 ) 潜在的OPTN 3-14% 准确性 (3% in Chinese, Leung et al 2003)

基因组-广泛连锁分析 POAG 家族 ABI 连锁定位 Set MD-10, 382 微卫星标记 ABI 基因扫描和基因型软件 两点参数连锁分析 MLINK 和 ILINK 程序, FASTLINK 版本 4.1P 软件包 基因鉴定

谱系 1 构成 5

谱系 2

基因扫描凝胶成像

基因型的等位基因大小

香港中文大学，眼科和视觉科学系 青光眼遗传学 13号染色体基因定位

香港中文大学，眼科和视觉科学系 青光眼遗传学 CP Pang Fion Lau DSC Lam Pancy Tam Eva Cheung Clement Tham BJ Fan Ricky Lai Dorothy Fan Dannie Wang YO Leung Arthur Cheng Ruby Lam John Chua Y F Leung Oscar Canlas, Robert Ritch

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