层 析 CHROMATOGRAPHY

掌握：层析的概念、一般原理 凝胶层析的基本原理 装层析柱的过程及装柱要求 熟悉：层析技术的分类 凝胶层析的特点 凝胶的结构与性质 了解：凝胶的选择 柱、样品、洗脱液的选择 凝胶的保存

一.概述 层析Chromatography(色谱),利用混合物中各组分的物理化学性质间的差异(溶解度、分子极性、分子大小、分子形状、吸附能力、分子亲合力等) ，使各组分在支持物上集中分布在不同区域，借此将各组分分离。

色谱历史 1903（1906）年，Michael Tswett提出色谱法 1931年，Kuhn采用柱色谱分离了类胡萝卜素 古罗马人分析混合染料（类似辐射纸色谱） 1903（1906）年，Michael Tswett提出色谱法 1931年，Kuhn采用柱色谱分离了类胡萝卜素 1941年，Martin和Synge提出分配色谱法 1944年，Martin等又提出纸色谱法 1952年，Martin和James发明了气液色谱法 1955年，第一台商品气相色谱问世，标志着现代色谱分析的建立 1956年，Stahl系统研究了薄层色谱法(TLC) 1906年，俄国植物学家茨维特(M.S.Tswett)研究植物叶子色素成分,用竖直的玻璃管,管内充填碳酸钙,然后将植物叶的石油醚浸取液由柱顶端加入,并继续用纯石油醚淋洗。因植物叶不同色素在柱内得到分离而形成不同颜色的谱带,茨维特称这种分离方法为“色谱法” （chromatography）。 德籍奥地利化学家R.Kuhn 等利用他的方法在纤维状氧化铝和碳酸钙的吸附柱上将过去一个世纪以来公认为单一的结晶状胡萝卜素分离成a 和b 两个同分异构体，并由所取得的纯胡萝卜素确定出了其分子式。 Kuhn正是由于在维生素和胡萝卜素的离析与结构分析中取得了重大研究成果而获得了1938年诺贝尔化学奖.

1958年，Stein和Moore研制出氨基酸分析仪，确定了核糖核酸的分子结构 1967年，Horvvath和Huber等研制了高效液相色谱(high-performance liquid chromatography,HPLC)仪 1975年，Small等提出离子色谱     20世纪80年代，超临界色谱 20世纪90年代，毛细管电泳（1809年Reŭss第一次电泳实验） 21世纪，联用技术、大分子色谱分离、制备色谱可望取得更大的发展

层析法进行时有两个相，一个相称为固定相(Stationary phase )，另一相称为流动相(Mobile phase )。由于各组分所受固定相的阻力和流动相的推力影响不同，各组分移动速度也各异，从而使各组分得到分离。

二.层析技术的分类 1. 按两相所处的状态分类 以液体作为流动相的层析称为液相层析，以气体作为流动相的称为气相层析。 其固定相也可有两种状态，一种是以固体作为吸附剂的固定相，另一种是以涂布在固体载体表面的液体作为固定相。

层析 气-固层析（gas-solid chromatography） 气相层析（gas-chromatography） 气-液层析（gas-liquid chromatography） 层析 液-固层析（liquid-solid chromatography） 液相层析（liquid-chromatography） 液-液层析（liquid-liquid chromatography）

2.按层析过程的机制可分为 .吸附层析(adsorption chromatography ) ----利用吸附剂对不同组分吸附 能力的不同加以分离的方法。 .分配层析(partition chromatography ) ----利用不同组分在流动相和固定相中的 分配系数不同而进行分离的方法。

.离子交换层析 （ion-exchange chromatography ） ----利用离子交换剂与各组分之间的离子亲和 力不同而进行层析分离的方法。 .凝胶层析（gel chromatography） ----利用不同组分之间分子大小不同，在通过凝胶介质时所受到的阻滞作用的差异而进行分离的方法。 .亲和层析（affinity chromatography） ----利用生物大分子之间特有亲和力的不同进分离纯化的方法。

3.按操作技术形式分类 .柱层析（colum chromatography） ----将固定相装在层析柱中，使样品 朝着一个方向移动，通过各组分随流动相流动而得到分离的方法。

纸层析（paper chrmatography） ----用纸作为液体的载体，样品点在 纸上随后展开达到分离鉴定的 方法。 .薄层层析（thin layper chromatography） ----将适当的吸附剂在玻璃板或 其他材料薄板上铺成薄层，样品 点在上面随后用流动相展开达 到分离鉴定的方法。

三.层析的一般原理

(Partition chromatography) 1.分配系数 (Partition chromatography) 混合物在层析过程中不管层析技术采用哪两种状态的相(流动相和固定相)都能达到分配平衡，用来叙述一种物质在两种特定相中的分配程度是用分配系数表示的。

分配系数----是一种物质在两种特定相中分配，在特定的温度时这个系数的值是一个常数，即: 溶质在固定相中的浓度 Cs K= ———————————— = —— 溶质在流动相中的浓度 Cm

有效分配系数：定义为化合物在一个相的总量除以另一个相中的总量。实际上是分配系数乘以两个相的体积比。 在不同的层析机制中,分配系数K的含义不同,在吸附层析中,K为吸附平衡常数;在分配层析中,K为分配系数;在离子交换层析中K为交换常数.

分配系数K值大,说明物质在层析中被固定相吸附得比较牢固,随流动相迁移的速度较慢,留在固定相中的时间较长,在洗脱液中后出峰。若分配系数K值小，则该物质在洗脱液中较早出峰。

从一个混合物中分离和纯化一种生物物质的纯度如何，取决于混合物中各组分K 值的差异程度。 混合物中各组分若 K值相差较大, 则能较易地把混合物中的生物物质分离。反之,K值相差较小,不易把混合物中的生物物质分离。

2.讨论层析中的移动情况 通常采用平衡过程的研究方法,把层析柱划分为若干连续部分,每个体系都达到平衡。 理论板数(n)：在层析柱上，溶剂连续不断加入，化合物在流动相和固定相中不断分配平衡，所发生的平衡次数称为理论板数。

凝胶层析 Gel Chromatography

一、定义 凝胶层析…是按照被分离物质分子大小,经过具有一定孔径的多孔物质进行分离的一种方法。其又称为凝胶过滤或分子筛过滤或排阻层析。

主要机理是分子筛效应,当被分离物质流经凝胶柱时,因各组份的分子大小不同,在凝胶受到的阻滞作用有差异,从而造成各组分在凝胶柱中的迁移速度不同得到分离。

二.基本原理 流动相（洗脱液） 固定相（凝胶） 原理：被分离物质中各组分的分子量不同 。

进入具有一定孔径的凝胶柱后,较大的分子不能进入凝胶孔隙中,被排阻在外,而较小的分子则能进入凝胶孔隙,加入洗脱剂后,大分子就随洗脱剂从凝胶间隙洗脱下来,受到的阻力小,其流速较快,小分子物质从上一层凝胶孔隙中出来又扩散到下一层凝胶孔隙中,这样多次反复,大分子物质先从柱中流出,小分子物质后流出 。

小分子由于扩散作用进入凝胶颗粒内部而被滞留,大分子被排阻在凝胶颗粒外面,在颗粒之间迅速通过。

凝胶层析过程的数理关系 柱床体积(VT) …… 即凝胶体积以及颗粒 内外间隙体积的总和。 VT = 1/4 D2h D是内壁的直径

洗脱体积（Ve）…即欲分离物质通过层析 柱洗脱下来所需洗脱液 的总体积。 外水体积（V0）…即存在于柱床内凝胶外 面空隙之间的水相体积， 相应于一般层析法中流 动相的体积。

内水体积（Ｖｉ）…即凝胶颗粒内部所含 水相的体积，它可从 干凝胶颗粒重量和吸 水重量求得。　 凝胶干体积（Ｖｇ）

ＶＴ＝Ｖ０+Ｖｉ＋Ｖｇ

洗脱体积与Ｖｏ及Ｖｉ之间的关系 Ｖｅ＝Ｖｏ＋ＫｄＶｉ Ｋｄ＝（Ｖｅ－Ｖｏ）／Ｖｉ

Ｋｄ为样品组分的分配系数，也可以说 Ｋｄ是分子量不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系数。 它只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长短粗细无关，也就是说它对每一物质为常数与柱的物理条件无关。

Ｋｄ可通过实验求得。 Ve为实际测得洗脱体积。 Vo可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液（最好有颜色以便于观察如Hb、印度黑墨水）通过实际测量求出.Vi可由g·Wr求得（g为干凝胶重,单位为克,Wr为凝胶的吸水量以ml/g表示）。

Ve - Vo Kd = ———— Vi （1）Kd = 0时,Ve = Vo,意味着该分子完全被排阻于凝胶颗粒之外,全部分布于流动相里,在固定相分布为0,而最先流出。 （2）当Kd = 1时,Ve = Vo + Vi,意味着该分子完全不被排阻,可以自由地扩散进入凝胶颗粒内部,它能均等地分布在流动相和固定相里,在两相分配的比值为1,而最后流出. （3）当0 <Kd <1, Ve = Vo + ViKd为处于两种极端行为之间的分子。

（4）Kd >1现象说明凝胶对组分有吸附作用,此时Ve>Vo + Vi,例如一些芳香族化合物的洗脱体积远远超出理论计算的最大值,这些化合物的Kd >1如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。

因此分子的正常Kd值0~1之间,这种由小到大的Kd值顺序决定了物质流出的顺序。

Ve与MW的关系 对同一类型的化合物,洗脱特性与组分的分子量有关,流过凝胶柱时,按分子量(MW)大小顺序流出,MW大的走在前面,Ve与MW的关系可用下式表示: Ve = K1 - K2lgMW K1 K2 为常数, MW为分子量

三.凝胶层析的特点

（一）优点 1.凝胶是一种不带电荷的惰性载体。其结 构稳定,所以凝胶本身不与样品发生化 学反应。 2.凝胶层析的操作条件较温和,不易引起生  1.凝胶是一种不带电荷的惰性载体。其结     构稳定,所以凝胶本身不与样品发生化     学反应。 2.凝胶层析的操作条件较温和,不易引起生 物物质的变性,即使用来分离一些理化性 质不稳定的物质也很少被破坏。 3.样品得率高,重复性好.如果按比例扩大柱 的体积和高度,可进行大量样品的分离纯 化。

（二）缺点 1.要求样品和洗脱液的粘度很低。 2.凝胶颗粒网络孔径大小非常有限,所以可被 纯化的物质的分子量范围受到限制。 3.凝胶结构对某些溶质分子具有吸附作用,如 芳香族化合物与脂蛋白等。  

四.凝胶的结构与性能 1.葡聚糖凝胶（商品名为Sephadex） 结构： 葡聚糖用交联剂1-氯代-2 ,3-环丙烷使葡聚糖之间通过醚键(C-O-CH2-CH-CH2-O-)交联 聚合而成的三维空间网状结构。 OH

特点： Sephadex 的三维空间网状结构的网孔大小取决于交联度,交联度的大小可在合成Sephadex 时控制加入交联剂的百分比决定.交联剂的百分比高,交联度大,网状结构愈紧密,孔隙愈小,吸水后膨胀也愈小,机械强度高,分离物质的分子量也小。反之,交联剂的百分比低,分离物质的分子量大。G类Sephadex的型号表示每克干凝胶吸水量x10,如G-50表示每克干凝胶吸水量为5ml。 Sephadex的化学性质稳定,不溶于水、盐、弱酸和碱, 耐热耐碱不耐酸。

2.琼脂糖凝胶（商品名为Sepharose) 它是一种大孔凝胶,其工作范围的下限几乎是 Sephadex的上限,可分离MW40万以上的物质,因此可用来分离核酸及病毒。 琼脂糖凝胶不带电荷,不受微生物作用而降解,但对热不稳定,易受pH影响(只在pH4.5-9.0范围内稳定.

使用范围及效果同葡聚糖凝胶相似,但化学性质较葡聚糖稳定,可在pH2-11范围内使用. 3.聚丙烯酰胺凝胶 使用范围及效果同葡聚糖凝胶相似,但化学性质较葡聚糖稳定,可在pH2-11范围内使用. 聚丙烯酰胺凝胶的商品为生物胶－P （Bio-Gel P），由美国Bio-Rod厂生产，型号很多，从P-2至P-300共10种，P 后面的数字再乘1000就相当于该凝胶的排阻限度。 是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位， 由甲叉双丙烯酰胺交联成的，经干燥粉碎或加工成形制成粒状，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶。交联剂越多，孔隙越小。

4.凝胶的选择 选择何种凝胶以及它的型号,这需要根据实验条件,溶质的分子量的大小和分离工作的目的而定,每种型号凝胶都有一定分离溶质分子量的范围,选择的型号凝胶要能满足实验要求。

六.其它条件选择 1.柱的选择 层析的长度（L）与直径（D）之比（L/D）对层析分辨率有影响,一般对用于组别分离的层析柱其L/D为15～18：1,层析柱的体积一般大于样品体积的4～10倍,这类常用于脱盐.对于分级分离可采用L/D 40：1,甚至100：1,层析柱体积一般大于样品体积的25倍。 柱短而粗,则易使样品稀释,柱长而窄,则柱的管壁效应较大,会造成拖尾现象。

2.样品的选择： 量适当, 粘度小。 3.洗脱液的选择： 每种样品分离所用的缓冲洗脱液应根据使样品稳定的原则使用。

七.应用 1.分离纯化 2.脱盐 3.高分子溶液的浓缩 4.测分子量

凝胶层析法分离蛋白质

[原理] 血红蛋白（Hb，分子量64 480左右）与二硝基苯—鱼精蛋白（DNP—鱼精蛋白，分子量2 000—12 000）混合物，由于分子大小不同，通过Sephadex G—50层析受阻滞程度有差异，从而达到分离。

[器材] 层析柱（1.5×25ml） 等 [试剂] 1.样品液：DNP-鱼精蛋白、Hb 2.Sephadex G-50

[操作] 1. 装柱：在层析柱的底部出口套上乳胶塑料管，向层析柱内加蒸馏水赶走在层析柱的死体积和接口处的气泡，在蒸馏水高度约占体积的1/3时，关闭下端出口，自顶部缓缓加入已处理好的Sephadex G-50悬液，待底部凝胶沉积1~2cm时，再打开出口，凝胶加至凝胶沉积离层析柱口约3cm即可。

装柱注意点： 不得有气泡和分层 ； 凝胶表面应平整 ； 柱床体积稳定； 不能让凝胶表面露出水面。

2. 加样：取样品液5滴即为上柱样品。将出口打开，使表面的蒸馏水流出，直至恰好与表面相平（不可使床面干掉），关紧出口，用滴管将上述样品缓缓地加到床表面，注意尽量不要使平整的床表面搅动，然后打开出口，让样品进入床内，直至床面恰好露出，用上法不断加蒸馏水洗涤 ，立即用试管收集，待红色流尽，换试管收集。

3. 观察实验现象，并计算Hb的洗脱体积（Ve）和DNP-鱼精蛋白的Ve。 4.再生 用蒸馏水洗涤凝胶层析柱10分钟，此柱即可再生。

Chromatographic column Stationary phase Mobile phase or eluent 把菊根粉或白垩粉（CaCO3）装在玻璃管中，将植物叶子的石油醚提取液倒入管中，然后加入石油醚淋洗。随着淋洗进行，样品中各种色素向下移动的速度不同，逐渐形成一圈圈的连续色带。茨维特在当时的实验中观察到6个色带，它们分别是胡萝卜素、叶黄素和叶绿素A和B。 提取液 色带 Chromatographic column Stationary phase Mobile phase or eluent

The mobile (top) and stationary (bottom) phases in column chromatography.

Paper chromatography is an analytical method. Note the very small sample volume spotted onto the plate.