Recombinant DNA Technology 主讲：李志红

后续内容 重组DNA技术（基因克隆） 基因的体外表达与蛋白质的纯化 癌基因与抑癌基因 考试

Gene Cloning What does the term cloning mean? What is gene cloning? How does it differ from cloning an entire organism? Why is gene cloning done? How is gene cloning accomplished ?

照亮细胞的荧光蛋白 转基因植物

脑神经网络 （Brainbow）

绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP ) 在宣布获奖名单时，瑞典皇家科学院诺贝尔化学奖评审委员会主席贡纳尔·冯·海涅手持一支试管，内装用绿色荧光蛋白基因改造过的大肠杆菌。用紫外线照射后，试管发出绿色荧光。冯·海涅说，这种级别的发现“能让科学家的心跳比平时快上三倍”。 美联社援引哈佛大学医学和放射医学副教授约翰·弗兰焦尼的话评价说：“这一技术彻底改变了医学研究。研究人员第一次能在活体细胞和活生生的动物身上同时研究基因与蛋白。”

Cloning - a definition From the Greek - klon, a twig Clone: a collection of molecules or cells, all identical to an original molecule or cell. Also named asexual multiplication.

(Recombinant DNA technology) 指应用酶学方法，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代DNA分子的过程。

重组DNA技术操作过程 重组DNA技术操作过程可形象归纳为 分 分离目的基因 切 限制酶切目的基因与载体 接 拼接重组体 转 转入受体菌 筛 筛选重组体

1.分 基因克隆总体技术路线图 2.切 3.接 4.转 5.筛

第一节 载体（vector） Definition: allowing the exogenous DNA to be inserted, stored, and manipulated mainly at DNA level. 一、载体的分类 按功能分：克隆型载体、表达型载体 按受体细胞分： 原核细胞载体 真核细胞载体 穿梭载体 按载体来源分：质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、酵母人工染色体、粘粒载体

载体的选择标准 能自主复制； 具有两个以上的遗传标记，便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。 多克隆位点 ori 复制起始点 遗传标记 Amp polylinker

质粒载体pBR322 复制起始点 (ori) 选择标记 (ampr tetr) 单一的酶切位点 “P”表示是一种质粒； “BR”表示两位主要构建者姓氏的头一个字母“F.Bilivar和R.L.Rodriguez”; “322”表示实验编号。

二、不同载体的特点和分类 （一）质粒载体 质粒(plasmid)－是存在于细菌染色体外的小的共价、闭环双链DNA分子，能自主复制，并在细胞分裂时遗传给子代细胞。 质粒可赋予宿主细胞一些遗传性状如抗药性等，通过质粒赋予细菌的表型可识别质粒的存在，这是筛选重组转化子的基础。

作为载体的质粒一般具有以下特点 作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的质粒载体。 分子相对较小（3～10 kb）； 松驰型复制； 具有适当的多克隆位点以便外源DNA插入； 具有插入失活筛选标志，便于从平板上直接筛选阳性重组子； 质粒能携带的外源DNA片段一般较小（<15kb）； 作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的质粒载体。

MCS－multiple cloning site 在pBR322的基础上，组入了一个在其5’-端带有一段多克隆位点的lacZ’基因，具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。

生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使氯霉素失去毒性 几种常用的抗生素抗性基因 genotype 编码产物 功能（phenotype） Ampr（氨苄青霉素抗性基因） β-内酰胺酶 水解β－内酰胺环，解除氨苄毒性 Tetr（四环素抗性基因） 1种膜蛋白 可以阻止四环素进入细胞 Camr（氯霉素抗性基因） 乙酰转移酶 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使氯霉素失去毒性 Neor（新霉素抗性基因） 氨基糖苷磷酸转移酶 使G418（长那霉素衍生物）失活 Hygr（潮霉素抗性基因） 潮霉素β磷酸转移酶 使潮霉素β失活

（二）噬菌体载体 线性双链DNA分子 插入型载体/替代型载体 用于构建基因组文库和cDNA文库

λ phage 溶源阶段 (整合到寄主染色体上) 溶菌阶段 (复制和释放)

48.5 kb in length Linear or circular genome (cos ends)

λ phage cos cos DNA Protein coat Long (left) short (right) arm arm 12bp Nonessential region Exogenous DNA (~20-23 kb)

λ重组体DNA分子的体外包装 体外包装：把重组DNA分子包装成成熟的噬菌体颗粒 包装限制：λ噬菌体的包装能力，控制在野生型λDNA长度(48kb)的75%-105% 包装上限51kb ，必要基因28kb，故克隆上限为23kb.

Bacteriophage vectors Advantages: Useful for cloning large DNA fragments (10 - 23 kb) Inherent size selection for large inserts Disadvantages: Less easy to handle

（三）人工染色体 人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百甚至上千kb 的DNA片段， 此时柯斯质粒和噬菌粒载体的装载量也远远不能满足需要。 将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。 当大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人工染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。 酵母人工染色体（Yeast Artificial Chromosomes, YAC） 细菌人工染色体（Bacterial Artificial Chromosomes, BAC） 容量大！！！

细菌人工染色体 (BAC) 细菌人工染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上构建的，其装载量范围在50 - 300 kb之间。 各种类型的pBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝。 pBACs主要适用于： 克隆大型基因簇（gene cluster）结构 构建动植物基因文库

BAC载体 CmR: 氯霉素抗性基因 装载量范围: 50 - 300 kb parA、parB: 控制拷贝数 repE: 控制F质粒复制

酵母人工染色体（YAC) 酵母人工染色体由酵母染色体的着丝粒(cen4)、自主复制序列(ARS1)和来自四膜虫的端粒(Tel)等功能性DNA序列组成。它可携带长达200-1000kb的DNA片段，因此在人基因组DNA大片段的克隆中非常有用，是染色体克隆排序的主要工具。 用酵母人工染色体克隆DNA的过程与λ噬菌体相似，将DNA大片段与载体的两臂相联，然后将连接混合物转化进酵母细胞中，利用载体上的选择性标记进行筛选。

YAC载体 可携带长达200-1000kb的DNA片段 正常酵母人工染色体含有： * 四膜虫端粒（tel) * 酵母自主复制序列（ARS) * 酵母着丝点 (CEN) * 酵母的选择标记 (TRP1、URA3)

BACs and YACs Advantages: Disadvantages: Useful for cloning extremely large DNA fragments (100 - 2,000 kb) This is very important for genome sequencing projects Disadvantages: Not easy to handle extremely large DNA molecules

（五）病毒载体 质粒和噬菌体载体只能在细菌中繁殖，不能满足真核DNA重组需要。 感染动物的病毒可改造用作动物细胞的载体 DNA病毒载体,RNA病毒载体 常用病毒载体:猴肾病毒SV40（Simian Virus 40）、逆转录病毒和昆虫杆状病毒等 目的：外源蛋白表达或研究其功能, 基因治疗等。

逆转录病毒载体

What determines the choice of vector? insert size vector size restriction sites copy number cloning efficiency ability to screen for inserts what down-stream experiments do you plan?

第二节 基因工程中常用的工具酶 限制性核酸内切酶 切割DNA DNA连接酶 生成3′- 5′磷酸二酯键 DNA聚合酶Ⅰ 第二节 基因工程中常用的工具酶 限制性核酸内切酶 切割DNA DNA连接酶 生成3′- 5′磷酸二酯键 DNA聚合酶Ⅰ 探针标记、补平3′末端 反转录酶 cDNA合成 多聚核苷酸激酶 5′磷酸化、探针标记 末端转移酶 3′末端多聚尾 碱性磷酸酶 切除末端磷酸基团

（一）限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease, RE) 限制性核酸内切酶--能识别并切割特定的核苷酸序列（回文序列） 粘性末端 平末端 核酸内切酶的发现 Daniel Nathans, Werner Arber, and Hamilton Smith. Nobel Prize in Medicine in 1978

分类 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型） 作用 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。

命名 Hin dⅢ 第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶 属 种 株 序 第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。 前三个字母用斜体

+ + Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome) GTCGAC CAGCTG GGATCC CCTAGG GTC CAG 切口 ：平端切口、粘端切口 HindⅡ Bam HⅠ GTCGAC CAGCTG GGATCC CCTAGG 左下角处有超级链接到配伍末端 GTC CAG GAC CTG GATCC G + + G CCTAG 平端切口(blunt end) 粘端切口(sticky end)

同功异源酶 + + 来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。 Bam HⅠ GGATCC CCTAGG G CCTAG BstⅠ GGATCC CCTAGG GATCC G G CCTAG +

同尾酶 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。 Bam HⅠ Bg lⅡ GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGA A TCTAG GATCT A GATCC G + G CCTAG +

（二）DNA连接酶 T4 DNA连接酶 连接反应最适温度12～20℃ 平末端连接温度可适当提高！

T4 DNA ligase

（三）DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶 I Klenow聚合酶 －补平、标记探针、合成cDNA 、测序！！ 3  5  外切活性、聚合活性 Taq DNA聚合酶－PCR 反转录酶－RT-PCR 聚合活性、RNaseH 活性

（四）其它修饰酶 碱性磷酸酶－切除5端的磷酸基，防止自身环化 末端脱氧核苷酸转移酶－寡核苷酸探针的末端标记

第三节 目的基因的获得 目的基因（外源基因） cDNA /基因组DNA 直接从染色体DNA中分离 化学合成 第三节 目的基因的获得 目的基因（外源基因） cDNA /基因组DNA 直接从染色体DNA中分离 化学合成 PCR或RT-PCR体外扩增目的基因 从基因组文库中筛选 向目的基因所有者或其所在的实验室索取

化学合成法主要适用于已知核苷酸序列的、分子量较小的目的基因的制备，采用DNA自动合成仪进行. * 化学合成法获取目的基因 化学合成法主要适用于已知核苷酸序列的、分子量较小的目的基因的制备，采用DNA自动合成仪进行. 由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列

从基因组DNA文库获取目的基因 组织或细胞染色体DNA 限制性内切酶 基因片断 基因组DNA文库(genomic library) 存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合 克隆载体 重组DNA分子 受体菌 含重组分子的转化菌

用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库 限制酶切位点 真核生物染 色体DNA cos L R cos 限制酶消化 除去中间片段 限制酶部分消化 ~20 Kb DNA 片段 cos L 左臂 R cos 右臂 外源DNA与载体DNA混合 cos L R cos ~20 Kb 外源 DNA 片段 连接反应 体外包装 基因文库 用重组噬菌体 感染大肠杆菌 用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库 目 录

从基因组文库中钓

从cDNA文库(cDNA library)获取目的基因 mRNA cDNA 双链cDNA 重组DNA分子 cDNA文库 反转录酶 载体 受体菌 复制

是一种在体外利用酶促反应大量获得特异序列的基因组DNA或cDNA的专门技术，又称为无细胞的分子克隆。 聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR） 　　是一种在体外利用酶促反应大量获得特异序列的基因组DNA或cDNA的专门技术，又称为无细胞的分子克隆。 1985年由穆里斯（K. Mullis）发明，他也因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。

PCR：体外由引物介导的DNA酶促合成，也叫基因扩增 变性 95˚C 延伸 72˚C 退火 Tm-5˚C 变性 退火 延伸 25～30 次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上

第四节 目的基因和载体的连接 粘端－粘端连接 粘端－平端连接 平端－平端连接 其它连接方式 人工接头 T载体 定向克隆

粘端－平端连接 定向克隆的概念

The addition of a homopolymer tail (同聚物加尾）

目的基因加接头

载体加接头

Artificial linker （人工接头）

第五节 重组DNA导入受体细胞 受体菌的条件 安全宿主菌 遗传背景清楚！ 处于感受态(Competent cells) 受体细胞 特殊处理 受体细胞 受体菌的条件 安全宿主菌 遗传背景清楚！ HB101；JM109；DH5a 处于感受态(Competent cells) 即容易接受外源DNA的状态。

转化 (transformation)：质粒为载体 转染 (transfection)：噬菌体和病毒为载体 导入方式 转化 (transformation)：质粒为载体 转染 (transfection)：噬菌体和病毒为载体 转化(Transformation): 是将外源DNA分子引入受体细胞, 使之获得新的遗传性状的一种手段。 转化的主要方法 电击法 CaCl2

CaCl2处理 受体细菌 重组体转入细菌 50-100mmol/L CaCl2 感受态细菌 其原理是： 转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面; 经42℃短时间热击处理，可促进细胞吸收DNA复合物。

基因重组 噬菌体 体外包装 转染 噬菌体体外包装

第六节 重组DNA分子的鉴定 基因克隆的最后一步是从转化细菌菌落中筛选出含有阳性重组子的菌落，并鉴定重组子的正确性。 通过细菌培养以及重组子的扩增，获得所需的基因片段的大量拷贝。进一步研究该基因的结构、功能，或表达该基因的产物。

利用宿主细胞遗传表型的改变来筛选 抗药性标志筛选 插入失活 β－半乳糖苷酶系统筛选 分析重组子分子结构特性进行鉴定 内切酶图谱鉴定 Southern 印迹杂交 菌落原位杂交 PCR鉴定 测序

1. 抗药性标志的筛选 如果克隆载体带有某种抗药性标志基因如ampr或tetr ，转化后只有含这种抗药基因的转化子细菌才能在含该抗菌素的平板上幸存并形成菌落，这样就可将转化菌与非转化菌区别开来。 如果重组DNA时将外源基因插入标志基因内，该标志基因失活，通过有无抗菌素培养基对比培养，可区分单纯载体或重组载体（含外源基因）的转化菌落。 插入失活

抗药性标志的选择 DNA重组体与质粒自身环化的鉴别：插入失活法 pBR322 Tet平板 Amp平板 Amp Tet 插入片段 Ampr Tets Ampr Tetr

Screening of the clone The medium in this petri dish contains the antibiotic Kanamycin The bacteria on the right contain Kanr, a plasmid that is resistant to Kanamycin, while the one on the left has no resistance Note the difference in growth

β－半乳糖苷酶系统筛选 （蓝白斑筛选） 很多载体都携带一段细菌的lacZ基因，它编码β－半乳糖苷酶N-端的146个氨基酸，称为α－肽； 载体转化的宿主细胞为lacZΔ15基因型，它表达β－半乳糖苷酶的C-端肽链； 当载体与宿主细胞同时表达两个片段时，宿主细胞才有β－半乳糖苷酶活性，使特异的底物X-gal 变为兰色化合物，这就是所谓的α－互补； 而重组子由于基因插入使α－肽基因失活，不能形成α－互补，在含X-gal的平板上，含阳性重组子的细菌为无色菌落或噬菌斑。

标志补救（ α互补，ß-半乳糖苷酶法） lacZ Am N2H 片段 COOH 片段

X-gal：5- 溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷 Lac Z 蓝色化合物 X-gal：5- 溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷

lacZ α 互补的检测 目 录

Blue/White Color Screening with Recombinant Plasmids

3. 内切酶图谱鉴定 经初筛鉴定有重组子的菌落，小量培养后，再分离出重组质粒或重组噬菌体DNA,用相应的内切酶切割，释放出插入片断。 凝胶电泳检测 加样孔 DNA Marker 空质粒 重组质粒 重组质粒酶切 重组质粒的PCR扩增片段

4. 通过PCR筛选重组子 一些载体的外源DNA插入位点两侧存在特定的序列，如启动子序列等，利用这些特异性序列作为引物，对小量制备的质粒DNA进行聚合酶链反应（PCR）分析，不但可迅速扩增插入片断，判断是否阳性重组子，还可直接对插入进行DNA 序列分析。

5. 菌落或噬菌斑原位杂交 先将转化菌落或噬菌斑直接铺在硝酸纤维素膜或琼脂平板上，再转移至另一膜上，然后用标记的特异DNA探针进行分子杂交，挑选阳性菌落。 该法能进行大规模操作，一次可筛选多达5×105-5×106个菌落或噬菌斑，特别适于从基因文库中挑选目的基因。

Detecting the DNA sequence of a cloned gene with a probe (DNA hybridization)

菌落原位杂交

基因载体 目的基因 有切口的载体 有切口的目的基因 带重组体的宿主细胞 目的基因的表达 质粒 噬菌体 病毒 限制性内切酶 Flash 质粒 噬菌体 病毒 PCR cDNA 人工合成 基因文库 限制性内切酶 重组DNA技术操作的主要步骤 有切口的载体 有切口的目的基因 DNA连接酶 重组体 转化 转染 体外包装 带重组体的宿主细胞 表型筛选 电泳法 核酸杂交 免疫学方法 目的基因的表达

Key Points 基本概念： 基因克隆的主要步骤 载体的种类、特点 常用的工具酶及其特点 获得目的基因的主要方法 基因工程（基因克隆，重组DNA技术）； 限制性核酸内切酶，粘性末端，平头末端； 基因组文库，cDNA文库，定向克隆； 感受态细胞，转化，转染； 插入失活法，蓝白斑筛选 基因克隆的主要步骤 载体的种类、特点 常用的工具酶及其特点 获得目的基因的主要方法 鉴定重组DNA分子的主要方法