第16章 植物原生质体融合技术 Plant Protoplast Fusion

学习目的：了解植物原生质体的制备和融合技术，了解杂种细胞的筛选和鉴定方法。 重点：植物原生质体的制备和融合技术 难点：植物杂种细胞筛选

内容 前言 16.1植物原生质体制备 16.2植物原生质体融合 16.3植物杂种细胞筛选 16.4植物杂种细胞鉴定 16.5植物体细胞融合意义

前言 植物原生质体的概念 植物原生质体融合的涵义 植物原生质体融合的发展

植物原生质体的概念 原生质体就是除去了细胞壁的裸露的球形细胞。 原生质体具有一切活细胞的特性，同时具有许多细胞完整细胞不具备的特点。这些特点和植物细胞全能性结合起来，使植物原生质体在遗传工程和体细胞遗传学中开辟了一个理论和应用研究的崭新领域。

纯化后的叶肉原生质体

植物原生质体融合 原生质体融合(protoplast fusion)：指通过物理或化学方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。 还包括融合后的重组细胞分化再生形成新物种的技术过程。

植物细胞杂交的几个重要进展 1960年，Cocking用酶法制备高等植物原生质体首次获得成功； 1970年，Power首次用硝酸钠进行为诱导剂进行了较大规模的原生质体诱导融合； 1971年，Nagata和Takebe首次从离体烟草原生质体培养中获得再生完整植株； 1972年，Carlson首次获得粉蓝烟草和郎氏烟草的细胞杂种，这也是第一个植物细胞杂种； 1974年，Kao将聚乙二醇诱导融合法应用于植物细胞融合并建立了相应的融合技术； 1978年，Melchers获得了第一个属间细胞杂种（番茄＋马铃薯）； 1981年，Zimmerman发明了电融合仪，并首次提出了电融合概念； 1987年，Schweiger建立了单对原生质体电融合技术程序。

原生质体材料来源 ★ 植物叶片 ★ 植物根尖组织 ★ 植物花粉 ★ 愈伤组织、悬浮培养的细胞 －取材容易 －比较容易用酶解法分离 －可由各种植物的种子萌发后取得 ★ 植物花粉 －产生单倍体原生质体 ★ 愈伤组织、悬浮培养的细胞 －细胞壁容易解离

16.1植物原生质体的制备 16.1.1植物原生质体的分离 16.1.2植物原生质体的制备影响 16.1.3植物原生质体的纯化 16.1.4植物原生质体的培养方法

16.1.1植物原生质体的分离 常用的分离方法 机械分离法 酶解分离法

★ 机械分离法 －先将细胞放在高渗溶液中预处理，待细胞发生轻微质壁分离，原体质体收缩成球形式，再用机械法磨碎细胞，从伤口处可以释放出完整的原生质体。 －优点：该方法可避免酶制剂对原生质体的破坏作用。 －缺点：获得完整的原生质体的数量比较少。

★ 酶解分离法 常用的细胞壁降解酶种类：纤维素酶类（纤维素酶、半纤维素酶、崩溃酶[Driselase]）、果胶酶类（果胶酶和离析酶[Macerozyme]）、蜗牛酶和胼胝质酶。 优点：可以获得大量的原生质体，而且几乎所有的植物或它们的器官组织或细胞均可用酶解法获得原生质体。 缺点：酶制剂中均含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶以及酚类物质。影响所获原生质体的活力。

原生质体的分离步骤 （一）取材（叶肉细胞） 充分展开的嫩叶。 洗涤、消毒、无菌水冲洗。 对禾本科植物叶片消毒时，使用苄烷铵（Zephiran）（0.1%） - 酒精（10%）溶液漂洗5分钟效果最好。 （二）酶解 原生质体分离的情况在很大程度上取决于所用酶的性质和浓度。 纤维素酶主要分解细胞壁纤维素。 果胶酶主要降解细胞壁间的中胶层。 有些组织在制备原生质体时，可能还会需要半纤维素酶。 离析酶是一种工程酶，可把植物组织分离成单细胞, 与纤维素酶配合使用制备高等植物原生质体 。

16.1.2影响原生质体数量和活力的因素 1）材料特性与降解酶： 2）渗透压稳定剂： 3）质膜稳定剂： 4）酶液的pH值： 5）温度因子 25-27 ℃ 6）植物材料的生理状态：如株龄、发育状态、栽培条件等对取材影响很大；

1）材料特性与降解酶： 不同种类植物或不同组织和细胞，其细胞壁的组成和结构有差异； 植物的细胞壁特性决定了分离原生质体所用的降解酶种类与组合

2）渗透压稳定剂： 渗透压在原生质体制备中，不仅起到保护原生质体免于膨胀破裂，而且还有助于酶和底物的结合，原生质体从组织中加快释放。 常用的如甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、盐类（KCl, MgSO4.7H2O)等；

3）质膜稳定剂： 增加对质膜的稳定性；促进原生质体细胞壁再生以及细胞分裂。 如葡聚糖硫酸钾、氯化钙、磷酸二氢钾、MES( 2-N-吗啉乙烷磺酸)等

4）酶液的pH值： 取决于植物材料，一般在5.4-6.0； pH值低，酶活性强，分离快，但易于损害细胞，原生质体产率低；

植物材料的生理状态： 如株龄、发育状态、栽培条件等对取材影响很大； 一般选取体细胞分裂旺盛的材料； 选取愈伤组织或胚状体效果更好。

刚游离出来的叶肉原生质体

16.1.3 植物原生质体的纯化 酶解后的混合物中将含有完整的原生质体、亚细胞碎屑（叶绿体、维管成分）、未被消化的细胞等，因而必须将这些杂质除去。 初步筛选：利用50-70µm孔径的镍丝网过滤混合物，收集滤出液，做进一步的纯化。

1）过滤法 利用孔径更小的镍丝网过滤最初的滤出液进行纯化。

2）离心沉降法 将上述滤出液置于离心管中，在70g-100g下离心2-3分钟，原生质体将沉于管底，细胞碎屑浮于上清液中。

3）漂浮法 利用比重大于原生质体的高渗蔗糖溶液做离心液，将经过镍网初筛的过滤液置于蔗糖溶液的顶部，在100g下离心10分钟，离心后，碎屑沉淀，纯净的原生质体将出现在蔗糖溶液和原生质体冲洗液的界面上。 利用移液管将原生质体吸出，转移到另一个离心管中，用冲洗液冲洗3次。 离心液的蔗糖浓度为20-21%。

4）梯度离心法 A：6%的聚蔗糖和9%的聚蔗糖（溶于其他盐类和7%山梨醇中），组成梯度离心液，经150g离心5分钟。细胞残片留于管底，原生质体上浮。 B：400g 离心5分钟，在蔗糖层之上出现纯净的原生质体层，碎屑在管底。

16.1.4原生质体鉴定与活力测定 （1）原生质体鉴定：判断是否真正为原生质体。 两种主要方法： 低渗爆破法：显微镜观察，原生质体胀破后则无残迹。 荧光染色法：原生质体放入离心管→加入0.7mol/L甘露醇配制的0.05%~0.1%荧光增白剂溶液，染色5~10min→离心洗涤除去多余染料→荧光显微镜360~440nm→绿色荧光显示纤维素的存在，红色光为无纤维素的原生质体。

（2）活力测定 染色法：二乙酸荧光素(FDA)法，活力原生质体发荧光。 酚藏花红染料法：活力原生质体吸收染料显红色，无活力者不吸收染料显白色。 伊文思蓝染色法：有活力者不吸收染料为无色，无活力者吸收染料显蓝色。 胞质环流法：显微观察。 渗透压变化：体积不变者为已死亡原生质体。 氧电极法：有活力者光照下会进行光合作用而放氧，无光照下进行呼吸而耗氧。

16.1.4 原生质体的培养方法 （一）液体培养法 （二）固体平板培养法 （三）双层培养法 （四）看护培养法 （五）悬滴培养法

（一）液体培养法 1、液体浅层培养 将原生质体悬浮于液体培养基中，在培养皿或培养瓶中培养，液层厚度1mm。 2、液体小滴法培养 将原生质体悬浮于液体培养基中，用吸管吸取原生质体的悬浮液，滴于6cm直径的培养皿中培养，液滴大小在 0.1-0.2ml左右 。 优点：培养方便，利于补充新鲜培养基，利于培养物的转移和分离。

（二）固体平板培养法 将原生质体接种于固体培养基中，在培养皿或培养瓶中培养，培养基厚度1mm。 优点：原生质体的位置固定不变，为定点跟踪观察原生质体的发育过程提供了方便。

固体平板培养

（三）双层培养法 在培养皿的底部为固体培养基，在固体培养基上滴加原生质体悬浮液。 优点：固体培养基能够不断地补充液体培养基中的营养，液体培养基不易干枯。

(四)看守培养与饲养层培养法： 看守培养(nurse culture)：指用一块活跃生长的愈伤组织来看守单个原生质体或细胞，使其持续分裂和增值的一种培养方法。优点是简便、成功率高。 饲养层培养(nutritive/feeder layer culture)：是指用处理（如X射线）过的无活性的或分裂很慢、不具备分裂代谢能力的细胞来饲养所需培养的原生质体或细胞，使其分裂和生长的培养方法。

饲养层培养具体方法：四种 饲养细胞与原生质体共同混合于琼脂培养基中； 两者分别混于琼脂培养基，前者位于下层，后者位于上层； 两者一起混于液体培养基培养； 双层滤纸培养植板培养。

(5) 悬浮培养法(cell suspension culture)与悬滴培养法(hanging drop technique)

影响原生质体培养的因素 （一）原生质体活力测定 （二）培养时的密度 （三）培养基 （四）光照：最初两周暗培养；分化时补充光照培养 （五）温度：随培养物的种类而不同。

16.2 植物原生质体融合 根据融合时细胞的完整程度，原生质体融合可分为两大类： 　　 对称融合（asymmetric fusion）－即两个完整的细胞原生质体融合。 　　 非对称融合（symmetric fusion）－利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再进行融合

16.2.1原生质体融合技术 原生质体可以自发地发生融合，但融合频率极低，在体细胞杂交中没有意义。 在体细胞杂交中，通常都是采用物理的和化学的方法人工诱导产生融合

（一）化学诱导融合的方法和机制 1、盐类融合法 优点：盐类融合剂对原生质体破坏小。 Carlson等（1972）利用这种方法产生了第一个体细胞杂种。 优点：盐类融合剂对原生质体破坏小。 缺点：融合的频率低、异核体的频率低。对液泡化发达的原生质体不易诱发融合 常用盐类：硝酸盐类；氯化物；葡聚糖硫酸盐

2、高钙高pH值法 Ca2+浓度 0.05 mol/L； pH 9.5-10.5 融合容易； Keller和Melchers（1973）利用强碱性（pH10.5）的高浓度钙离子（50mmol/LCaCl2.2H2O）溶液在37℃，处理30分钟诱导了两个烟草品系叶肉细胞的原生质体发生了融合。 Ca2+浓度 0.05 mol/L； pH 9.5-10.5 融合容易； 但对于有些原生质体体系来说，如此高的pH值也许是有害的。

3，聚乙二醇（PEG）法, 是目前原生质体融合的主流技术 聚乙二醇分子式为HOCH2（CH2-O-CH2）nCH2OH，水溶性 融合机制：可能是由于带有大量负电荷的PEG分子和原生质体表面的负电荷间在钙离子的连接下形成静电键，在原生质体之间形成分子桥，促使异源的原生质体间的粘着结合。 优点：融合频率高，异核体频率高，重复性强，毒性低，产生的融合没有特异性，可以使动物-动物、动物-植物以及植物-植物的原生质体发生融合。

对PEG融合效果的影响因子： PEG浓度：25-30% PEG的分子量：1500-6000 钙离子浓度：50m mol/l， 作用时间：15-30分钟 原生质体的浓度：4~5%的原生质体的悬浮液（原生质体的容积/液体容积）。

4 PEG高钙高pH值法 利用强碱性高浓度钙离子溶液清洗PEG，引起原生质体表面电荷紊乱并重排，促进细胞融合。

操作过程： 1)收集两种亲本原生质体，高密度等体积混合； 2)混悬液滴3滴于载玻片，放置10min，加PEG溶液450μL; 3)静置10～20min，加0.5mL高pH、高Ca2+溶液，10min后再加1次； 4)10min后加1mL原生质体培养基洗涤5次，间隔5min/次； 5)最后加入300～500μL原生质体培养基，微滴培养。

PEG、高ca2+、高pH相结合融合法植物原生质体融合步骤： 酶解除壁原生质体→PEG加热熔化与Eagle溶液配成50%(W/V)浓度(小分子量55%)→原生质体PEG中，24℃培育10～20min(时间过长，会使原生质体周围形成一层膜凝集体，会降低融合率)→缓缓加入高pH高钙离子溶液→ 15min后冲洗液清洗→离心收集原生质体。

（二）物理诱导融合的方法和机制 电融合 将悬浮细胞在低压交流电场中聚集成串珠状细胞群，或将培养细胞形成单层接触，然后加高压电脉冲引发质膜破裂，进而促使异质细胞的质膜连接，最终形成融合体。

电融合的过程 细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串； 膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。

电融合的优缺点 电融合具有很多优点。首先，不必象显微注射那样使用玻璃针，不需要技术培训和昂贵的设备，可以一次对成百万的细胞进行注射。第二，与用化学物质相比，电穿孔几乎没有生物或化学副作用，免去PEG诱导后的洗涤过程，诱导过程可控性强。第三，因为电穿孔是一种物理方法，较少依赖细胞类型，因而应用广泛。 不同的材料发生融合所需的条件不同，不好掌握。设备昂贵。

影响电融合的因素 影响电融合的因素有电融合技术中交流电的强弱、处理时间的长短、电脉冲的大小电极的材料和间距、直流脉冲的强度、宽幅以及次数等。

电融合的过程

16.2.2 融合体 双亲原生质体融合时， 质膜融合→细胞质融合→细胞核融合； 根据形成融合体的双亲本的来源，可分为 异核体(heterokaryon)或异核细胞 基因型不同的原生质体融合成杂交细胞 同核体(homokaryon) 基因型相同的原生质体融合成的杂交细胞

自体融合 and 异体融合 自体融合：发生在亲本原生质体自身 异体融合 谐和的细胞杂种：具有双亲全套染色体组的异源两倍体 部分谐和的细胞杂种：双亲的染色体经逐步排斥，便发生少量染色体的重组，然后进入同步分裂，最后形成带有部分重组染色体的植株 异胞质体细胞杂种：亲本的染色体全部被排斥，但胞质是双亲的 嵌合细胞杂种：不同种的双亲原生质体，发生了膜融合和胞质融合，尚未发生核融合。双亲的细胞核各自发生核分裂，接着形成细胞壁，最终形成嵌合体植物

16.3 杂种细胞的筛选 融合后的混合产物中有亲本的原生质体、同核体、异核体，应加以选择，筛选出杂种细胞。

（一）互补法筛选 利用两个亲本对培养基、抗代谢物、或温度等的敏感性存在着天然的互补性进行选择叫互补法选择。也可以利用隐性基因的互补性进行选择。

1、激素自养型筛选 粉蓝烟草和郎氏烟草的野生型叶肉细胞原生质体是激素异养型细胞，且原生质体不分裂；杂种细胞是激素自养型细胞，且在没有激素的培养基上可以旺盛分裂。使融合产物在不含激素的培养基上培养，能够产生细胞团的就是融合的原生质体。

1、两步法激素自养型筛选

2、营养缺陷型突变互补 硝酸还原酶的蛋白突变体和辅因子突变体，突变体不能利用硝态氮，只能利用铵态氮。 两者的突变位点不同，原生质体融合后，硝酸还原酶恢复，可以利用硝态氮。

3、利用对抗代谢物质的敏感性互补进行筛选

（一）标记法筛选 方便，不用对培养物的生理性状有许多的了解，适用范围广。 1、根据可见标志选择 利用叶肉细胞和培养细胞原生质体的天然色泽标记进行选择。 在低密度培养条件下可以实现。 油菜叶肉细胞的原生质体与拟南芥的培养细胞的原生质体融合，培养3-5天后，在显微镜下用微吸管将融合产物（4-8个细胞的细胞团）转移，进行微室培养。

2、利用荧光标记物标记进行选择 在形态上无法区分的原生质体，可以采用该方法进行选择。 硫氰酸荧光素发绿色荧光，碱性蕊香红荧光素发红色荧光，利用这两种荧光染料分别对不同的原生质体染色，诱导原生质体融合后，在显微镜下镜检，发两种荧光的即为杂种细胞。 也可以利用电子分拣技术进行分拣，速度快（5103个细胞/秒）。 荧光标记并不影响原生质体的再生。

16.4 体细胞杂种植株的鉴定 如果原生质体融合得到的细胞杂种，其所具有的染色体数目恰巧为双亲染色体数目之和，称这种细胞杂种为双二倍体。 实际上，融合产物中真正的双二倍体并不多见，往往都会出现染色体数目的不正常现象。 染色体数目不正常的原因： 1、质核互作，2、 两个以上的原生质体发生了融合。

体细胞杂种的鉴定法 1、形态学 是否具有双亲植株的形态学性状，例如马铃薯番茄的植株具有双亲的形态。 2、细胞学 对杂种植株进行核型分析。利用染色体显带技术，以亲本染色体为对照，对细胞杂种的染色体数目、形态和带型进行观察。 3、分子生物学 对杂种植株进行DNA分子杂交，验证是否有外源 DNA 的导入。 4、生化分析 同工酶谱分析，根据亲本和杂种同功酶谱的差异来鉴别杂种。有的呈双亲谱带的总和、有的出现新谱带或丢失部分亲本谱带。常用的鉴定酶为：乙醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、过氧化物酶、酯酶等。

16.5 植物原生质体融合的意义： ◆克服种、属以上植物有性杂交不亲和性障碍 ◆为携带外源遗传物质的大分子渗入细胞创造条件

植物原生质体在理论研究和细胞工程中的地位 融合产生体细胞杂种 分离各种细胞器 引入各种细胞器 导入外源基因 诱发突变体 信息传递、能量转换 细胞壁合成机理 膜的结构与功能 核质关系 杂交或自交不亲和的机理 细胞间的相互作用 植物激素的作用机理