重组蛋白药物纯化与质量控制 医药生物技术中试实验 邬婧 2017.5.3

Contents 蛋白纯化原则与方法 1 蛋白质量控制方法 2 LOGO www.themegallery.com

蛋白纯化原则 现代生物 技术 给人类带来了抗体和药物。 LOGO 基因重组 技术 生化分离 技术 免疫检测 技术 www.themegallery.com

蛋白纯化原则 LOGO www.themegallery.com

蛋白纯化原则 Guidelines for Protein Purification 确定目标 purity, quantity, biological activity, economy 充分了解目的蛋白及主要杂质的理化特性 to simplify technique selection and optimisation 确定活性测定方法 fast detection of protein activity/recovery and critical contaminants 尽量减少纯化步骤 extra steps reduce yield and increase time, combine steps logically LOGO www.themegallery.com

纯化流程 动物 培养物 原材料的获取 植物 LOGO www.themegallery.com

纯化流程 LOGO www.themegallery.com

纯化流程 原材料的获取 LOGO 保 存 预处理 细胞破碎 蛋白溶解 酸、碱 醇 去垢剂 尿素 …… 粗 提 沉淀 相分离 分子筛 精 提 各种色谱 电泳分离 差速离心 研磨 超声 渗透压 酶 浓缩 保存状态 保存条件 保存期限 …… LOGO www.themegallery.com

纯化流程 LOGO www.themegallery.com

Concentration and stabilization (e.g. removal of proteases) Capture Initial purification of the target molecule from crude or clarified source material Concentration and stabilization (e.g. removal of proteases) Resolution Speed Capacity Recovery LOGO www.themegallery.com

Intermediate Purification Removal of bulk impurities Resolution Speed Capacity Recovery LOGO www.themegallery.com

Polishing Final removal of trace contaminants, e.g. structural variants of the target protein Resolution Speed Capacity Recovery LOGO www.themegallery.com

纯化流程 一般生产纯化不超过4个步骤。 LOGO www.themegallery.com

分离纯化机制 不同的大小和尺寸 带电基团 疏水基团 极性不同 相互作用 LOGO www.themegallery.com

分离纯化机制 不同层析介质的成本：离子交换，金属螯合，疏水层析，分子筛，亲和层析 LOGO www.themegallery.com

关键杂质 产品浓度 引进污染物 产品纯度 单位成本 产量 纯化总结 稳定性（PH值，活性） 等电点 疏水性 分子大小，形状。 关键辅助因子 检测方法-质量控制 纯化方法 LOGO www.themegallery.com

纯化总结 LOGO www.themegallery.com

纯化总结 Develop assay methods Set the aims Characterize the target protein Use different separation principles Use few steps Limit sample handling between purification steps Remove proteases quickly Reduce volume in early step TRY! LOGO www.themegallery.com

重组蛋白药物的质量控制 效 价（活性） 鉴 定 安 全 性 杂 质 稳 定 性 一 致 性 蛋白质含量 纯 度 分子生物学 生物化学 免疫学 Contents 效 价（活性） 鉴 定 安 全 性 杂 质 稳 定 性 一 致 性 蛋白质含量 细胞生物学 微生物学 免疫学 生物化学 纯 度 分子生物学 19 LOGO www.themegallery.com

常规质量控制方法 SDS-PAGE Western Blot ELISA HPLC 20 LOGO www.themegallery.com

电泳(E) SDS-PAGE 带电颗粒（蛋白质）在电场作用下，在PAG上向着与其电荷相反的电极移动，从而达到分离的效果。 单体：丙烯酰胺(Acr) 交联剂：甲叉双丙烯酰胺(Bis) 聚合剂：过硫酸铵（APS） 催化剂：四甲基乙二胺(TEMED） 产物：三维网状结构的凝胶. 电泳(E) 带电颗粒（蛋白质）在电场作用下，在PAG上向着与其电荷相反的电极移动，从而达到分离的效果。 21 LOGO www.themegallery.com

SDS-PAGE 蛋白质在PAGE中的分离因素 电荷因素 分子大小 分子形状 22 LOGO www.themegallery.com

SDS-PAGE 灵敏度1mg (1) 纯度分析 (2) 分子量的测定 (3) 初步鉴定 (4) 含量的测定 (配合扫描半定量) (5) 水解的分析 (如酶谱法) (6) Western Blotting的前部分 (7) 氨基酸序列分析-结合质谱

SDS-PAGE LOGO www.themegallery.com

SDS-PAGE 电泳出现两条或者两条以上条带 免疫印迹 LOGO www.themegallery.com

印迹法(Blotting) Western印迹法 Werstern Blot 将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品。 通过电泳将样品中的不同蛋白分离开，然后将蛋白样品转移到固相载体上，利用相应的抗体来检测目的蛋白的一种方法。 LOGO www.themegallery.com

膜的特点 27 LOGO www.themegallery.com

转移方法 Werstern Blot 半干转 湿转 LOGO 用滤纸吸Buffer来做转移体系 适合转移小分子量的蛋白； 半干转的电流大小是按照面积来算的， 时间是根据 蛋白分子大小定的； 56mA/膜 1h 湿转 将膜、胶、滤纸全浸泡在Buffer的Tank里 适合转移大分子量（100KD以上）蛋白； 湿转电流是恒定的，时间也是根据分子量而定； 300mA 1h 28 LOGO www.themegallery.com

直接法 Werstern Blot 优点： 缺点： LOGO 1.快速（一种抗体） 2.没有二抗交叉反应引起的非特异性条带 1.免疫反应性降低 2.无信号二级放大 3.抗体标记费时昂贵,使用不方便 LOGO www.themegallery.com

间接法 Werstern Blot 优点： 缺点： LOGO 1. 免疫特异性不受标记影响 2. 信号放大灵敏度高（多个二抗结合位点） 3. 多种标记的二抗可供选择 4. 可选择不同的Marker 缺点： 1. 交叉反应引起的非特异性条带 2. 额外的二抗孵育以及条件优化 LOGO www.themegallery.com

Werstern Blot 显色 放射自显影 LOGO 底物化学发光ECL 底物荧光ECF 底物DAB呈色 显色方法 代表类型 特点 酶促底物发光法 DAB显色法 稳定性好，灵敏度较高（250pg），背景一般，成像性较差，药品疑有一定致癌性。 化学发光法 （推荐使用） ECL发光法 稳定性好，灵敏度高（10-12g），背景可以很低，成像性好，且可以重复标记。 显色 　 放射自显影 底物化学发光ECL 底物荧光ECF 底物DAB呈色 ECL:（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。 LOGO www.themegallery.com

Werstern Blot 灵敏度1-5ng 目的蛋白的表达特性分析 目的蛋白的组织定位 目的蛋白与其它蛋白的互作 目的蛋白的表达量分析

Werstern Blot Step1 蛋白提取 Step2 蛋白定量 Step3 SDS-PAGE Step4 转膜 Step5 封闭 33 LOGO 33 www.themegallery.com

ELISA(Enzyme-linked Immunosorbent Assay) 用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗体或抗原的方法。 优点：快速、灵敏、定性、定量、定位，是目前应用最广泛的免疫学检测技术。 LOGO www.themegallery.com

（1） 直接法测定抗原 ELISA A. 将待测抗原吸附在载体表面； B. 加酶标抗体，形成抗原—抗体复合物； C. 加底物。 LOGO （1）  直接法测定抗原 A.      将待测抗原吸附在载体表面； B.      加酶标抗体，形成抗原—抗体复合物； C. 加底物。 LOGO www.themegallery.com

（2）间接法测定抗体 ELISA A. 将抗原吸附于固相载体表面； B. 加待测抗体, 形成抗原-抗体复合物; C.      加酶标抗体；形成抗原-抗体-抗抗体复合物； D. 加底物。 LOGO www.themegallery.com

（3）双抗体夹心法测定抗原 ELISA A. 将抗体吸附于固相表面; B. 加待测抗原，形成抗原-抗体复合物; C.     加酶标抗体，形成抗体-抗原-抗体的夹心复合物； D. 加底物。 用抗体包被固相载体 加入抗原Sample(二价以上)，温育 加入酶标抗体，温育 加入底物，显色 LOGO www.themegallery.com

ELISA A. 将抗体吸附在固相载体表面; B. 同时加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体； 对照只加入酶标抗原； （4）竞争法测定抗原 A.     将抗体吸附在固相载体表面; B. 同时加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体； 对照只加入酶标抗原； C. 加底物。对照孔与样品孔差＝未知抗原量。 待测抗原 酶标抗原 LOGO www.themegallery.com

ELISA 灵敏（纳克水平）、特异、简单、快速、易于自动化操作。 一天之内可以检查几百甚至上千份标本，高通量检测筛选。 应用： 1、定量检测抗原或抗体成份。   2、研究抗酶抗体的合成。 3、显现微量的免疫沉淀反应。 4、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。

工作原理 HPLC 分离系统 数据处理系统 输液系统 进样系统 检测系统 www.hfwykj.com 首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。 输液系统 进样系统 检测系统 HPLC是以液体为流动相，并用高压输送，色谱柱采用填充颗粒十分细小的高效分离柱，柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测. www.hfwykj.com

HPLC 类 型 主要分离机理 主要分析对象或应用领域 吸附色谱 吸附能，氢键 异构体分离、族分离，制备 分配色谱 疏水分配作用 各种有机物分离、分析与制备 凝胶色谱 溶质分子大小 高分子分离，分子量及其分布的测定 离子交换色谱 库仑力 无机离子、有机离子分析 离子排斥色谱 Donnan膜平衡 有机酸、氨基酸、醇、醛分析 离子对色谱 离子性物质分析 手性色谱 立体效应 手性异构体分离，药物纯化 亲和色谱 生化特异亲和力 蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析

HPLC的图形结果 HPLC 色谱图(Chromatogram) : 色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图,其纵坐标为信号强度,横坐标为时间 响应值 ←色谱峰 峰宽 峰高 基线 ↓ 时间(分)

HPLC 从色谱流出曲线中，可得许多重要信息： 根据色谱峰的个数，可以判断样品中所 含组分的最少个数 根据色谱峰的保留值，可以进行定性分析 根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析 根据色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据 根据色谱峰两峰间的距离，是评价固定相（或流动相）选择是否合适的依据(R值）

Application HPLC 灵敏度0.1ng/mL 在生化中,主要用在下面几处: 1．纯度； 2．分子量； 3．肽谱; 4．分离制备蛋白质和肽； 5．脱盐。

常规质量控制方法 SDS-PAGE Western Blot ELISA HPLC 45 LOGO www.themegallery.com

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SOP: Standard Operation Procedure 标准作业程序 LOGO www.themegallery.com

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What is QC＆QA?

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