植物组织培养 Plant tissue culture

【课程内容概述】 植物组织培养是近三十多年来发展相当迅速的一门技术性科学。这一技术又与生物工程中其他技术有密切关系，不论是重组技术、细胞工程、酶工程和发酵工程都必须经组织培养技术才得以实现。本课程主要从发展历史、基本原理、操作技术、应用现状和前景诸方面进行讲授，让学生了解近百年来植物组织细胞培养研究的进展、技术程序和应用，弄清其成败的关键和措施，初步掌握植物组织细胞培养这一实用技术的基础理论和技术。 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

第一章 植物组织培养的概述 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

【主要内容】 一.植物组织培养的定义 二.植物组织培养的过程 三.植物组织培养的基本概念 四.植物组织培养的理论基础 ——细胞的全能性 五.植物组织培养发展简史 六.植物组织培养应用领域 七.植物组织培养目前存在的困境 八.植物组织培养今后的对策 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

【学习目的与要求】 掌握植物组织培养的基本概念、基本理论及组织培养的基本过程 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

一.植物组织培养的定义 在无菌和人工控制的条件下,将离体的植物器官、组织、细胞和原生质体，培养在人工控制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终形成完整的植株。 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

植物组织培养的分类 1.根据培养材料的分类 （1）愈伤组织培养 （2）悬浮细胞培养 （3）器官培养 （4）茎尖分生组织培养 （5）原生质体培养，其中愈伤组织培养是一种最常见的培养形式。 2.根据培养目的分类 （1） 试管繁殖 （2）试管加倍 （3）试管受精 （4）试管嫁接 （5）试管育种 3.根据培养方法分类 （1）平板培养 （2）悬浮培养 （3）微室培养 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

二. 植物组织培养的过程 植物器官、组织、细胞脱离了植物体形成愈伤组织，才能表现出全能性。通过生长素和细胞分裂素共同作用，刺激愈伤组织的形成。愈伤组织形成后，改变生长素和细胞分裂的浓度配比，刺激愈伤组织的再分化，使其产生根和芽，进而分化成新的植物体。 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

植物组织培养过程 植物组织培养条件 含有全部营养成分的培养基、一定的温度、空气、无菌环境、适合的PH、适时光照等。 脱分化 愈伤组织 再分化 根 芽 离体的植物器官、组织、细胞 植物体 植物组织培养条件 含有全部营养成分的培养基、一定的温度、空气、无菌环境、适合的PH、适时光照等。 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

切取 接种 愈伤组织的形成 植物组织培养的操作过程 移栽 培养室 试管苗的形成 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

实例：非洲紫罗兰的组织培养 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

三. 植物组织培养的基本概念 1. 外植体：由活植物体上切取下来以进行培养的那部分组织、器官或细胞称之。外植体的种类如下： 茎 (芽)尖、子叶、胚、芽、茎(段)、幼叶、子房、下胚轴、花药、愈伤、小孢子、原生质体等。组织和器官外植体要求幼嫩，处于分生状态。 2. 愈伤组织：原是指植物在受伤后于伤口表面形成的一团薄壁细胞，在组培中，则指在人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞。特征：细胞排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞。 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

愈伤组织： 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

三. 植物组织培养的基本概念 3.脱分化和再分化：（将来自已分化组织的已停止分裂的细胞从植物体部分的抑制性影响下解脱出来，恢复细胞的分裂活性）由高度分化的植物器官、组织或细胞转变为分生状态并形成未分化的愈伤组织的过程叫脱分化。将脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官，这个过程叫再分化。 器官发生方式 再分化有两种方式 胚胎发生方式 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

四. 植物组织培养的理论基础 ——细胞的全能性 四. 植物组织培养的理论基础 ——细胞的全能性 1、什么是细胞的全能性？ 定义：细胞的全能性：一个细胞所具有的形成完整植株的固有能力，叫做细胞的全能性或是指组成多细胞生物体的每一个生活细胞，当处于适宜的外界条件下时可以进行独立的生长发育，并形成一个完整的生物个体的潜在能力）。 原因：从理论上讲，每个细胞都包含该物种的全部遗传物质（全部基因），所以每个活细胞都应具有全能性 。 全能性的比较：受精卵> 生殖细胞 >体细胞 植物细胞> 动物细胞 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

细胞全能性 Totipotentiality 植物细胞全能性—— 一个植物细胞所具有的产生完整植物个体的潜在能力。 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

五.植物组织培养发展简史 1838-1839年，德国科学家Schleide 和Schwann发表了细胞学说，奠定了组织培养的理论基础。 1902年，德国著名的植物学家Haberlant 根据细胞全能性理论，大胆提出了高等植物的器官和组织可以不断的分割，直至单个细胞的观点。但未得到实验证实。 1904年，Hanning Hanning最先在无机盐溶液及有机成分的培养基上成功的培养了萝卜和辣根菜的胚，结果发现离体胚均可充分发育，并有提早萌发形成小苗的现象。 1922年，Knudson 采用胚培养法获得大量兰花幼苗。 1925年，Laibach通过培养亚麻种间杂交形成的幼胚，成功地得到了杂种。 1933年，我国李继侗等在二十世纪三十年代就曾经做过银杏离体胚培养，发现3毫米以上大小的胚即可正常生长，以及银杏胚乳提取物能促进银杏离体胚的生长，这一发现对于后人使用植物胚乳汁液或幼小种子及果实的提取液促进培养组织的生长具有启蒙的意义。 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

五.植物组织培养发展简史 1934年，White 用番茄根尖建立起第一个活跃生长的无性繁殖系，从而使非胚器官的培养首先获得成功。 1957年， Skoog和Miller提出了植物激素控制器官形成的概念。 1958年，英国科学家Steward 等用胡萝卜根的愈伤组织细胞进行悬浮培养，成功诱导出胚状体并分化为完整的小植株，不但使细胞全能性理论得到证实，而且为组织培养的技术程序奠定了基础。 1962年，Murashige 和Skoog 在烟草培养中筛选出至今仍被广泛使用的MS培养基。 1964-1966年，印度科学家Guha 和Maheswari 在曼陀罗花药培养中首次由花粉诱导得到了单倍体植株。 1972年，Carlson 通过两个种的烟草原生质体融合培养，获得了第一个体细胞杂交的杂种植株。…… 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

五.植物组织培养发展简史 我国科学家在这方面研究开展得比较早的。1933年，李继侗等进行了银杏胚胎的培养；1935-1942年间，罗宗洛等进行了玉米等离体根尖的培养；随后崔澂关于烟草组织培养中器官发生的研究，罗士韦关于幼胚、茎尖的组织培养研究和根尖、愈伤组织、植物肿瘤组织及药用植物组织培养的研究，李正理等进行离体胚培养中形态发生及离体茎尖培养的研究；王伏雄等关于幼胚培养的研究；朱至清等1974年为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的N6。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培养和其他组织培养。 从二十世纪七十年代起，组织和细胞培养作为植物基因工程、突变体的产生和筛选，以及大规模培养和生产有用的植物次生代谢产物等的基础技术而受到重视，取得了很大的成就。 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

六.植物组织培养应用领域 　 1、快速繁殖 运用组织培养的途径，一个单株一年可以繁殖几万到几百万个植株。例如一株葡萄一年繁殖到3万多株，一株兰花一年繁殖到400万株。 　　2、种苗脱毒 针对病毒对农作物造成的严重危害，通过组织培养可以有效地培育出大量的无病毒种苗。已经取得成功的有马铃薯、草莓、香蕉、葡萄等等。 　　3、远缘杂交 利用组织培养可以使难度很大的远缘杂交取得成功，从而育成一些罕见的新物种。比如辽宁果树研究所利用这种方法获得苹果与梨的杂交种。 　　 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

六.植物组织培养应用领域 4、突变育种 采用组织培养可以直接诱变和筛选出具抗病、抗盐、高赖氨酸、高蛋白等优良性状的品种。象中国林科院用逐步加大培养基中盐的浓度，直接获得耐盐的杨树株系。 　　5、基因工程 基因工程主要研究DNA的转导，而基因转导后必须通过组织培养途径才能实现植株再生。 　　6、生物制品 有些极其昂贵的生物制品，如抗癌首选药物--紫杉醇等，可以用大规模培养植物细胞来直接生产。近年国内在红豆杉组织培养中获得生长量每升细胞培养物中紫杉醇的产量可达0.25mg。 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

七.植物组织培养目前存在的困境 1.组织培养的机理: 早期的组织培养研究，主要集中在基础探索上，如愈伤组织培养体系的建立，体细胞、性细胞，以及原生质体全能性的证实等，虽取得成绩，但很不深入，有关植物细胞全能性表达和激素的作用机理等未作深入研究，而且早期的研究所用材料是选择了胡萝卜、烟草、曼陀萝等易培养的植物, 这些植物的花粉小孢子接种在只含蔗糖和琼脂的培养基上就能发育成球形胚 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

七.植物组织培养目前存在的困境 2.“‘困难植物“’的组织培养 一些“困难植物”如多年生果树的组织培养技术却未作研究，本应该在易培养的植物取得成功后，与“困难植物”进行比较，深入系统地探讨一下为什么有的植物易培养，而有的植物却不容易培养的内在原因或机理，但多年来人们对这些问题未给予应有的重视，取而代之的是形成“要想培养成功必须选择合适的植物类型和基因型”的经验，正是由于此故，给植物组织培养研究的发展产生了不良的影响。 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

七.植物组织培养目前存在的困境 3.可应用范围较窄 由于目前还有相当多的植物没有相应的离体培养技术，因此无论它多么珍贵或濒危，无论它的细胞大量培养时产生的新产品开发多么有利用价值，也都无法利用离体培养技术。 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

七.植物组织培养目前存在的困境 4.效率偏低 重要植物的大部分成功的报道都存在着效率低的问题，如龙眼茎尖培养，增殖率、生根率（仅30％左右）偏低，不能直接应用于实际工作；Rohanec等（1993）在荞麦花药培养研究中，从7278个花药中只获得了99块愈伤组织和22个芽，类似研究还很多，如此低效率，很难解决实际问题。 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

七.植物组织培养目前存在的困境 5.操作烦琐 许多重要农作物及部分果树的原生质体培养相继报道成功，但目前这些技术还很难应有于遗传工程操作，除了基因型限制之外，还存在操作复杂、烦琐、完成周期较长等问题，如理想的悬浮系建立至少需要好几个月才能获得这些细胞系游离培养，到获得再生植株又要好几个月甚至一年以上, 如此长的时间，烦琐的操作以及结果不很稳定等因素，在实际生产上还难于应用。 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

七.植物组织培养目前存在的困境 6.培养结果难于确定 对那些具有相应培养技术的植物材料，生产上具体应用时，还会出现具体问题，如进行无性系繁殖，常常无法避免不希望的无性系变异产生；而进行无性系变异研究时，所期望的变异又出不来。其次，无性系变异及突变体筛选、保存材料时，常常需要长时间多代数的培养，这又是培养物产生变异、甚至丧失正常分化能力的原因所在. 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

八.植物组织培养今后的对策 组织细胞培养成功与否，取决于培养对象、培养基和培养条件之间是否配套。可以说，没有一种培养基是万能的，根据植物细胞全能性学说，没有一种基因型的植物是不可以培养的，因而我们应该重视采取的对策 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

1.重视有关的基础性研究 植物细胞全能性的表达和激素的作用机理； 探讨同一条件下易培养和困难培养基因型的内在生理生化差异； 改进一些“困难植物”的组织培养技术以提高其分化率和再生率； 探讨基因型、外植体、培养基、培养条件间的相互配合机制。 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

2.克服基因型限制问题 植物组织细胞培养中突出的问题是基因型限制问题，如果再像以前人们那样，习惯于从大量的基因型中筛选少数易培养类型来研究的办法就不可取了，只有坚持用大量的、广泛的各种类型的材料来研究，才能有助于发现不同基因型的作用本质和机理，才能揭示不同材料之间的特殊性, 获得使不同基因型培养成功的经验，才能有助于探讨组织培养的规律，建立适应性广的组织培养技术。 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

3.明确研究目标，了解农业生产的要求，加快成果的应用推广 植物组织、细胞培养研究中开发的项目要因时因地制宜加以扩充，尽量降低成本，使之产生更多经济效益。此外，我国植物资源丰富，但用于栽培和进行试种的不到十分之一，野生植物中有不少可提供各种有经济价值的种质资源，也应当加以利用。 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

4. 加强果树组织培养研究 对于多年生果树，由于有性世代较长，用多代自交的方法获得纯系几乎是不可能的，常规育种方法需要几十年才能培育出新品种，因而，要充分利用花药培养、体细胞杂交和体细胞突变体筛选等多种方法来缩短果树育种周期；其次，果树新品种的加速繁殖及优质果树的脱毒快繁与保存都是生产上亟待解决的问题。 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

5.注意各学科间的协作与配合 植物组织、细胞培养研究涉及植物学、植物生理学、细胞生物学、遗传学以及栽培育种等多个学科，需要熟悉各个学科之间的相互关系，适时引入分子生物学新技术； 进入大田生产时又涉及群体生理中不少问题，植物组织细胞培养和其它生物技术都需要与常规育种紧密结合才能更快地在农业生产中起作用，更好地发挥潜力。 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

参考书目 李浚明.植物组织培养教程（第三版）.中国农业大学出版社，2005 薛庆善.体外培养的原理与方法.科学出版社.2001（节选） 潘瑞炽.植物组织培养.广东高等教育出版社.2001 鄂征. 组织培养和分子细胞学技术.北京出版社.2001 奚元龄，颜昌敬. 植物细胞培养手册.农业出版社.1992 许智宏.植物生物技术.上海科学技术出版社.1998 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0

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【思考题】 1.名词解释 细胞的全能性 愈伤组织 脱分化 再分化 外植体 2.简述植物组织培养的过程 3.目前植物组织培养存在哪些瓶颈问题？如何克服？ 三峡大学 编写与制作 李晓玲 Copyright 1.0