第十二章　固相膜免疫测定

　第一节 概述

标记免疫测定 放射免疫测定 1960’ 酶免疫测定 1970’ 荧光免疫测定 1980’－1990’ 化学发光免疫测定 1990’－ 放射免疫测定 　 1960’ 酶免疫测定 　　 1970’ 荧光免疫测定 1980’－1990’ 化学发光免疫测定 1990’－ 膜固相免疫测定 1990’－

免疫测定分类 免疫浊度测定 Ag + Ab AgAb + Ab 标记免疫测定 Ag + Ab* Ag Ab* + Ab* （B） （F）

免疫测定原理 利用抗原抗体反应检测标本中微量物质 　抗原+抗体 抗原抗体复合物 Ag +Ab 　Ag * Ab

固相免疫测定 B与F分离 Ab* Ab* Ag + Ag + Ab* Ab Ab

固相膜的特点 多孔性 毛细管作用 非共价键高度吸附抗体或抗原 高度敏感性 易于漂洗 操作简便

常用的固相膜 玻璃纤维素(fiberglass)膜 尼龙(nylon)膜 聚偏氟乙稀( polyvinylidene fluoride ，PVDF)膜 硝酸纤维素（nitrocellulose，NC）膜

固相膜的技术要求 孔径：0.2~0.6 μm 流速：以ml/cm2/min表示 蛋白质结合力：吸附力很强，以μg/cm2表示 均一性

固相NC膜

第二节　免疫金标记技术

免疫金标记技术 免疫金标记技术(Immunogold labelling techique) 主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测。这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色（immunogold silver staining，IGSS）。

胶体金制备原理 　胶体金（colloidal gold）的制备一般采用还原法，常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。向一定浓度的金溶液内加入一定量的还原剂使金离子还原成金原子，形成金颗粒悬液，也称金溶胶（gold solution）。

胶体金的制备及特性 胶体金粒径 1%柠檬酸钠加入量 胶体金特性 （nm) （ml)* 呈色 lmax(nm) 16 2.00 橙色 518 24.5 1.50 橙红色 522 41 1.00 红色 525 71.5 0.70 紫色 535 *还原100 ml0.01%HAuCl4 所需量

胶 体 金（Colloidal Gold） 15~60 nm 优质 劣质

胶体金结合物（Conjugate）

第三节　膜载体免疫测定的种类与原理

固相微孔膜测定种类 斑点金免疫渗滤试验(dot immunogold filtration assay, DIGFA) 免疫层析试验（immunochromatography assay, ICA） 斑点ELISA (dot enzyme linked immunosorbent assay, Dot-ELISA) 酶联免疫斑点试验(enzyme linked immunospot , ELISPOT) 免疫印迹法(immunoblotting test, IBT) 放射免疫沉淀试验(radioimmunoprecipitation assay, RIPA)

IFA 和ICA 免疫渗滤测定 （IMMUNOFILTRATION ASSAY，IFA） 免疫层析测定 （IMMUNOCHROMATOGRAPHIC ASSAY，ICA）

IFA 穿流（FLOW THROUGH） ICA 横流（LATERAL FLOW）

免疫渗滤测定(IFA)

双抗体夹心法测抗原 IFA A B

免疫层析测定 ICA

ICA 试剂条 结 合 物 垫 样 品 垫 吸 水 垫 NC 膜

双抗体夹心法测抗原 ICA

间接法测抗体ICA

ICA 结果观察 阳性 阴性 无效

IFA与ICA的比较 IFA ICA 试剂形式 渗滤装置及附加试剂 试剂条 试剂保存 4~8℃ 6个月 室温一年 操作步骤 3~5 1 4~8℃ 6个月 室温一年 操作步骤 3~5 1 观察时间 3 min 3~20 min 阳性反应颜色浓度 操作结束颜色不变 颜色逐渐加深

膜固相免疫测定的特点 优点 不足之处 简便，快速 敏感度略低，价格略高（与ELISA比） 单份测定 精密度较差，质控困难 保存期长（优质试剂） 稳定性较差（普通试剂） 可测定物范围广（主要为定性试验） 不易制备定量、半定量试剂 感染性疾病的诊断 妊娠、排卵的诊断 肿瘤标志 心肌标志 滥用药物

GIFA技术的发展（间接法测抗体） 快速检测（渗滤法）原理图 固相膜 固相抗原 待测抗体 人IgG 固相抗人IgG抗体 金标记抗人IgG抗体 阳性 阴性 固相膜 固相抗原 待测抗体 人IgG 固相抗人IgG抗体 金标记抗人IgG抗体 快速检测（渗滤法）原理图

GIFA技术的发展 第一代 1988 HIVCHEK（DuPont） 单点， 5~10分钟， 血清， 金标试剂瓶装冻干品 第八代 INSTANTCHEK HIV 1+2 2点（测试+控制） 金标试剂：单人份、液体 样品： 血清、血浆、全血、 尿液 第九~十二代 研制中 单一试剂

ICA技术的发展 1990年 ABBOTT公司 胶体硒标记ICA Unipath公司 CLEARVIEW 立明衣原体 彩色胶乳标记ICA ROCHE Cardiac Reader TnT 定量 0.1~3 ng/ml 合成TnT质控点

半定量测定 IFA ICA S C 肌红蛋白 双孔法 S：测定孔 C：定量质控 100μg/L 微量白蛋白 单孔法 T：测定孔 C1：定量质控 30 mg/L C2：定量质控 200 mg/L 结果判定： （-） <30 （+） 30~100、 （++） 100~200 （+++） >200 mg/L ICA 甲胎蛋白（AFP） 参考值：30 μg/L 肝癌诊断值：>400 μg/L （-） <30 （+） 30~200 （++） 200~400 （+++） >400 μg/L 测 定 线 对 照 线 T C2 C1 S C

Dot-ELISA

ELISPOT 检测原理 细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后， 被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。 BCIP/NBT 底物孵育后， PVDF 孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过 CTL 公司生产的 ELISPOT 酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果。

ELISPOT 分析仪解决以下问题 哪些斑点是抗原特异性 T 细胞产生的（此斑点具有进一步分析价值），哪些是无关细胞产生的（此斑点没有 T 细胞研究价值） 斑点大小的意义 在对不同细胞因子计数和分析时，如何定义斑点最大和最小尺寸 如何从单个细胞基础上分析 实验精确度有多高？如果一个细胞产生相似的细胞因子，在多大程度上会干扰分析结果？ 几次重复实验才能使结果更有意义？

Elispot

Elispot结果判断

方法学评价

Westernblot原理

Westernblot缺点 抗原表位可能被破坏而漏检

放射免疫沉淀试验原理

放射免疫沉淀试验 抗原表位不会破坏