基因工程实验指导书
THE EXPERIMENTAL GUIDE FOR GENE ENGINEERING
马月萍 崔振波 编写
东北大学理学院生物技术研究所
二零零六年一月
实验须知
上好实验课是学好基因工程原理学的重要环节，它使同学们在验证课堂上所学理论知识、加深理解教师讲授内容的同时，还能使同学们得到基本实验技术、技巧的锻炼，为将来从事生物学基因工程方面的研究打下一定基础，因此必须予以足够的重视。为此，必须做到：
实验前预习实验指导书并复习有关内容
按实验指导及教师的要求进行观察，记载，写好实验报告，字迹要整洁、清楚。
爱护实验仪器、设备，注意节约药品和各种实验材料，按操作规程使用仪器，严禁私自拆卸仪器及调整仪器附件，如有损坏，照价赔偿。
注意安全，严格遵守操作规程，如遇特殊情况应及时报告指导教师。
保持实验室安静，不得在实验室内喧哗，不得迟到和早退，实验完毕将实验用品放回原来位置，各组轮流打扫卫生。
目 录
实验一 质粒DNA的小量提取与纯化 一 实验目的
1．学习质粒DNA的制备原理。
2．掌握用碱变性抽提法提取与纯化质粒DNA操作技术。
3．掌握水平式琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA技术。 二 实验原理
质粒是一类在细菌细胞内发现的，是存在于细胞质中的一类独立于染色体外，能够自主复制的环形双链的DNA分子。质粒DNA可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。质粒DNA编码的蛋白质往往赋予寄主细胞一定的表型特征，如各种抗性质粒、降解性质粒、致病性质粒等。
质粒DNA的提取与纯化是基因工程操作中常用的一项技术。质粒DNA的制备方法很多，其中常用的是碱裂解法小量制备质粒DNA。一般它们包括三个基本的步骤：细菌的生长和质粒的扩增；菌体的收集裂解，质粒DNA的提取；质粒DNA的纯化。 1．细菌的生长和质粒的扩增
从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到含适当抗生素的液体培养基中培养，对于高拷贝的质粒（pUC系列）来说，只要将培养物放到标准的LB或2YT培养基中生长到对数晚期，就可以大量提取质粒，而不必选择性地扩增质粒DNA，但对于拷贝数较低的质粒（如pBR322）来说，则需在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行选择性扩增。因为氯霉素可以抑制寄主菌的蛋白质合成，从而阻止了细菌染色体的复制，但是质粒则仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续上升。 2．细菌的收集、裂解和质粒DNA提取
细菌的收集可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采取多种方法，包括用非离子型去污剂、有机溶剂或碱处理及加热处理等。质粒DNA提取的基本原理是利用寄主菌（一般是大肠杆菌）DNA与质粒DNA之间的两种主要性质差异：
（1）大肠杆菌的染色体较一般的载体质粒DNA大得多。
（2）从细胞中提取得到的大肠杆菌DNA是变性的线性分子，而大多数质粒DNA是共价闭合的环状分子。
（3）环状质粒DNA较细菌的基因组DNA耐碱性强，细菌裂解物用碱性缓冲液处理后细菌的基因组DNA首先被裂解，通过离心与菌体碎片和各种蛋白质一起沉淀下来，环状质粒DNA存在于上清液中。
纯化质粒DNA的方法很多，通常使用的方法都是利用了质粒DNA相对较小和共价闭合环状这两个基本性质。多年来，绿化铯-溴化乙锭剃度平衡离心一直是制备大量质粒DNA的首选方法，然而该过程既昂贵又费时，为此发展了许多代替方法，其中主要包括利用离子交换层析、凝胶过滤层析，分级沉淀（聚乙二醇和LiCl分级沉淀法）等分离质粒DNA和宿主DNA的方法。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质及RNA，达到纯化的目的。
质粒DNA分子具有三种构型：共价闭合环形DNA（cccDNA, SC构型）、开环DNA（OC构型）和线性分子（L构型）在细菌体内，质粒DNA是以负超螺旋构型存在的。在琼脂糖凝胶电泳中不同构型的同一种质粒DNA，尽管分子量相同，但具有不同的电泳迁移率。其中走在最前沿的是SC DNA，其后依次是L DNA和OC DNA。 三 实验器材、试剂及材料 1．实验器材
超净工作台、台式离心机、微量加样器、恒温培养箱、恒温摇床、核酸电泳仪、电泳槽、小型混合器、冰箱、试管、1.5ml离心管 2．实验试剂
一次配制100ml, 然后高压灭菌15分钟。4℃保存。
配制好的溶液III含有3mol/L钾盐，5mol/L醋酸（pH4.8）
（7）50 x TAE缓冲液：242g Tris-碱，57. 1ml 冰醋酸，100ml 0. 5M EDTA(pH8 （7）50 x TAE缓冲液：242g Tris-碱，57.1ml 冰醋酸，100ml 0.5M EDTA(pH8.0),定容至1000ml.(用时稀释为1x)
（8）0.8%琼脂糖
（9）6x凝胶加样缓冲液: 0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（w/v）蔗糖水溶液。 3．实验材料
大肠杆菌：Top10
亚克隆载体：pUC19, 2.68kb 四 实验步骤 1．碱法小量制备质粒DNA
（1）挑取新鲜琼脂培养板上的单菌落，接种在3ml LB培养液中（含50μg/ml 氨苄青霉素），37℃振荡培养过夜。
（2）取1-1.5ml培养液移到1.5ml离心管中，12000rpm离心1分钟, 收集菌体。
（3）弃上清，将细菌沉淀悬浮于100μl冰预冷的溶液I中，强烈振荡混匀，室温搁置5分钟。
（4）加200μl溶液II，盖严管盖颠倒离心管几次以混合内容物，不要强烈振荡，置冰上5分钟, 使细胞膜完全裂解。
（5）加150μl溶液III，倒转几次混匀，冰上放置10分钟。此时酸中和碱，质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不溶性复合物，同时钾盐使游离SDS沉淀。
（6）12000rpm离心5分钟，沉淀染色体DNA及不溶的变性蛋白，取上清到一个新的离心管中。
（7）上清液用等体积的Tris-HCl饱和酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）抽提1~2次。
（8）上清液用等体积的氯仿：异戊醇（24:1）抽提1次。
（9）上清液加2倍体积的无水乙醇，混匀后室温放置10分钟
（10）12000rpm离心10分钟得到质粒DNA沉淀。
（11）弃上清，加1ml 70%乙醇漂洗沉淀，12000rpm离心5分钟。
（12）弃上清，将管倒置放在滤纸上，待乙醇完全蒸发。
（13）加入30μlTE缓冲液或ddH2O，溶解DNA，加入1µl RNaseA后混匀，37℃ 30分钟，消化小分子RNA。-20℃放置备用。
质粒DNA的浓度通常通过电泳来估算，取2ul质粒加入上样指示剂，进行琼脂糖凝胶电泳分析 3．1%琼脂糖凝胶的配制
（1）加100ml TAE或TBE缓冲液于三角瓶中。
（2）称取1克琼脂糖，于微波炉中加热至完全熔化
（3）冷却至60℃左右。
（4）加上溴化乙锭母液（100mg/ml）至终浓度为0.5ug/ml（5ul）,轻轻摇匀。
注：溴化乙锭（EB）为剧毒物，操作请戴手套。
（5）轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中，静置冷却30分钟以上。
（6）将胶板除去封胶带，加入电泳缓冲液（TAE或TBE）中，轻轻拔除梳子，即可上样。 五 注意事项
1．菌体生长时，一般新复壮的菌落为3~4小时，保存的菌落常需要12小时甚至更久，菌数不能太浓，因为衰老期的菌体其内源性DNase的释入，使得不易提取质粒，但是菌体数太低质粒将太少。
2．菌液离心后，上清应除干净，以免影响后面的酶切。
3．抽提用的苯酚和氯仿不能残留，否则将影响酶切。
4．沉淀后，用乙醇洗涤操作要适当，既要洗尽盐又要防止质粒的流失过多。 六 思考题
1．高拷贝的质粒为什么不需要在含抗性的培养基中进行选择培养？
2．如何将质粒DNA与寄主染色体DNA分离开？
3．质粒DNA分子有几种构型，在琼脂糖凝胶中迁移率如何分辨？
4．溶液II的作用是什么？
5．DNA分子在电泳缓冲液中带正电荷还是负电荷，在电场中的移动方向如何？
实验二 限制性内切酶消化质粒DNA 一 实验目的
1．掌握限制性内切酶消化质粒DNA的原理及其操作方法。
2．进一步学习水平式琼脂糖凝胶电泳的操作方法。 二 实验原理
限制性内切酶是在细菌对噬菌体的限制和修饰现象中发现的。细菌细胞内同时存在一对酶，分别为限制性内切酶（限制作用）和DNA甲基化酶（修饰作用）。它们对DNA底物有相同的识别序列，但生物功能却相反。由于细胞内存在DNA甲基化酶，它能在限制性内切酶所识别的若干碱基上甲基化，就避免了限制性内切酶对细胞自身DNA的切割破坏，而对感染的外来噬菌体DNA，因无甲基化而被切割破坏。所以限制性内切酶是该细菌细胞的卫士，它与DNA甲基化酶一起构成了保护自己的、抵抗外源入侵的DNA的防御机制。如果入侵的噬菌体DNA没有完全被限制性内切酶切割破坏，残留的噬菌体DNA在复制时，由于DNA甲基化酶的存在，同样地也在识别部位进行修饰---甲基化。限制性内切酶对这种复制后的噬菌体DNA就奈何不得，以至大量繁殖起来，使受体细胞也因此遭到灭顶之灾。
目前发现的限制性内切酶有数百种。EcoRI和HindIII都属于II型限制性内切酶，这类酶的特点是具有能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸顺序的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA的双链，形成一定长度和顺序的DNA片段。EcoRI和HindIII的识别序列和切口是：
G，A等核苷酸表示酶的识别序列，箭头表示酶切口。限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切口，就能产生多少个酶解片段，因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶中的区带数，就可以推断酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。
质粒的加工需要工具酶，限制性内切酶是重要的工具酶之一。将质粒和外源基因用限制性内切酶酶切，再经过退火DNA连接酶封闭切口，便可获得携带外源基因的重组质粒。
重组质粒可以转移到另一个生物细胞中去，进而复制、转录和表达外源基因产物。这样通过基因工程可获得所需要各种蛋白质产物。 三 实验器材、试剂及材料 1．实验器材
超净工作台、恒温水浴锅、台式离心机、微量加样器、核酸电泳仪、电泳槽、紫外透射仪、冰箱、1.5ml离心管、一次性手套 2．实验试剂
无菌H2O、10×酶切缓冲液、EcoRI限制性内切酶、电泳加样缓冲液、琼脂糖、1×TAE缓冲液 ３．实验材料：
质粒DNA（pUC19） 四 实验步骤
1．混合下列溶液于一个无菌的1.5ml离心管中，形成20μl的反应体系。
上述离心管内反应液混合均匀，然后置于37℃恒温水浴锅中温育2h。
2．从恒温水浴锅中取出装有反应液的离心管，加入4μl电泳加样缓冲液终止反应，混匀。
用0.8%水平式琼脂糖凝胶电泳和紫外透射仪鉴定酶切结果。 五 注意事项
DNA制品中的污染（如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高盐浓度）均能抑制酶切活性。这种抑制可通过增加酶作用单位数（10-20U/µg DNA）、增大反应体积以稀释可能的抑制剂或延长反应时间来加以克服。 六 思考题
1．常用的限制性内切酶属于哪一类内切酶，切割能产生几种末端？
2．影响限制性内切酶的因素有哪些？如果一个DNA酶解液在电泳后发现DNA未被切动,你认为可能是什么原因？
3．用双酶切时需要考虑哪些因素？不能用同一种缓冲液时，该如何进行酶切？
4．琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？
实验三 感受态细胞的制备 一 实验目的
1．掌握感受态细胞的制备的原理和技术
2．掌握转化的技术和方法 二 实验原理
在克隆技术中，转化（transformation）特指以质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。转染（transfection）是指噬菌体、病毒或以它作为载体构建的重组子导入细胞的过程。对于以噬菌体为媒介，将外源DNA导入细菌的过程，有人称之为转导（transduction）。
转化这一概念来源于遗传学：细菌细胞吸收外源DNA发生可遗传的改变叫转化。转化是一个自然存在的过程。细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。重组DNA转化细菌的技术操作关键就是通过化学方法，人工诱导细菌细胞进入一个敏感的感受态，以便外源DNA进入细菌内。这项技术始于Mandel和Higa1970年的观察，他们发现细菌经过冰冷的CaCl2溶液处理及短暂热休克后，容易被入噬菌体DNA感染。随后Cohn于1972年进一步证明质粒DNA用同样的方法也能进入细菌。
CaCl2转化法的基本原理是：细菌处于0℃，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基一钙磷酸复合物粘附于细胞表面：经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物；在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，被转化的细菌中的外源基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。
在CaCl2转化法的基础上，人们逐渐探讨了其它化学转化法，如MgCl2、CoCl2等。也有人对CaCl2转化法加以改进。另外电击转化法由于操作简便，转化率较高而越来越为人们所接受。 三 实验器材、试剂及材料 1．实验器材
无菌工作台，小型高速离心机，恒温摇床，恒温箱，-20℃冰箱，恒温水浴器，吸头，枪，试管，培养皿，1.5ml离心管 2．实验试剂
LB液体培养基，LA液体培养基及LA琼脂平板，0. 1mol／LCaCl2（CaCl2先配制成lmol／L，用0 LB液体培养基，LA液体培养基及LA琼脂平板，0.1mol／LCaCl2（CaCl2先配制成lmol／L，用0.22μm的滤膜过滤后贮存，使用前稀释至0.1mol/L，并用0.45μm的滤膜过滤后使用）。 3．实验材料
大肠杆菌： Top10或 DH5α菌株， 四 实验步骤（CaCl2转化法） 1．感受态细胞的制备
（1）宿主菌DH5α在LB培养基上划线，37℃培养16~20小时。
（2）挑单菌落移至含3ml LB的试管中，37℃强烈振荡培养过夜。
（3）第二天早测OD600值，经计算取出一定体积加入50ml LB中，使OD600约为0 （3）第二天早测OD600值，经计算取出一定体积加入50ml LB中，使OD600约为0.015。37℃振荡培养大约三小时，测试OD600值至0.5~0.6，这时细菌生长大约在对数生长期。
（4）将50ml培养基分至两个50ml离心管中，4℃，4000rpm离心10分钟。
（5）除尽上清液。
（6）共加入17m1（50ml的1／3倍）0.1M预冷的CaCl2（可先用lml重悬沉淀）。
（7）置于冰上30分钟。
（8）4℃，3000rpm离心10分钟。
（9）去掉上清。
（10）加入2ml CaCl2重悬细菌沉淀，分装。
（11）可立即使用或保存于4℃（不宜超过一周），或加15%甘油于-70℃保存。 2．转化
（1）对于已构建成功的高浓度重组质粒，取50μl感受态细胞，加入0.5μl重组质粒DNA；对于连接反应产物，一般加入3~5μl连接反应产物。
（2）置于冰上30分钟。 五 注意事项 1．CaCl2浓度
Ca2+浓度是影响转化的重要因素。随着CaCl2浓度的提高，转化效率提高，在0.075~0.1M时达到峰值，而超过0.1M效率反而下降。 2．感受态细胞的保存
后冰浴法制备的感受态细胞保存时间为30分钟时，转化效率和常规法无显著差异。感受态细胞在4℃保存的时间越长转化效率越高，3天左右达到峰值，随后逐渐吓降，但两周之内使用均可。 六 思考题
1．什么叫感受态？
2．为什么使用对数生长期的菌体细胞制备感受态？
3．影响转化成功的因素有哪些？
4．在感受态细胞制备与转化过程中为什么始终需要冰浴环境？
实验四 聚合酶链式反应（PCR）体外扩增质粒DNA 一 实验目的
掌握聚合酶链式反应（PCR）的原理及其操作方法。 二 实验原理
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction ，简称PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法。典型的PCR反应由高温变性、低温退火和适温延伸等三步反应组成一个循环周期，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是将待扩增的DNA置于高温下使之解链；人工合成的两个寡核苷酸引物在低温下分别在目的片段两侧与DNA两条链互补结合；DNA聚合酶在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，沿模板从5’向 3’方向延伸，合成DNA的新互补链。
PCR技术能在试管中建立反应，经数小时之后，就能将极微量的某一特定的目的DNA片段扩增106倍以上，而无需经过烦琐的基因克隆程序便可获得足够数量的精确的DNA拷贝。它操作简单，易于掌握，结果也较为可靠，为基因的分析和研究提供了一种强有力的手段，对整个生命科学的研究与发展都有深远的影响。因此，得到广泛应用。可用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析、突变体和重组体的构建、基因表达调控的研究、基因多态性分析、遗传病和传染病的诊断、肿瘤机制的探索及法医鉴定等诸多方面。PCR技术在分子克隆和DNA分析中有着如下多种用途：
1．制备双链DNA中的特异序列作为探针；
2．由少量mRNA制备cDNA文库；
3．由cDNA克隆某些基因；
4．制备大量DNA以进行序列测定；
5．突变的分析；
6．染色体步移；
7．RAPD、AFLP、RFLP、等DNA多态性分析。
PCR反应体系应具备以下原料：DNA模板、寡核苷酸DNA引物、热稳定的DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）、反应缓冲液，脱氧核苷三磷酸底物dNTP等五部分组成，缺一不可：
1．模板
单双链DNA或RNA都可以作为PCR的样品。若起始材料是RNA，一般须先通过逆转录得到第一链cDNA。虽然PCR可以仅用极微量的样品，但为了保证反应的特异性，一般还宜用μg水平的染色体DNA或104拷贝的待扩增片段作为起始材料。原材料可以是粗制品，某些材料甚至仅需用溶剂一步提取之后即可用于扩增，但混有任何蛋白酶、核酸酶、TaqDNA抑制剂以及能结合DNA的蛋白，将可能干扰PCR反应。
2．引物：引物是决定PCR结果的关键因素，下列原则有助于引物的合理设计：
（1）引物的长度以15~30bp为宜，其Tm = 4（G+C）+2（A+T）,一般（G+C）的含量在45~55%，应尽量避免数个嘌呤或嘧啶的连续排列（尽量避免有三个以上连续相同的碱基），碱基的分布应是随机的。
（2）两个引物在3’端不应出现同源性，避免引物形成内部二级结构，3’端的末位碱基在很大程度上影响着Taq酶的延伸效率，研究表明选T，G，C为最好。
（3）人工合成的寡聚核苷酸引物最好经过PAGE或离子交换HPLC进行纯化。
（4）引物浓度不宜偏高，浓度过高有两个弊端，一是容易形成引物二聚体（primer-dimer）, 二是当扩增微量靶目标并且起始材料又比较粗时，容易产生非特异产物。一般来说，用低浓度引物不仅经济，而且反应特异性比较好，一般用0.25~0.5pmol/µl较好。
（5）新订的引物来了以后，在未开盖前稍加离心，然后用TE配成较高浓度的母液（约100µM），保存于-20℃。取出其中一部分用ddH2O配制成10µM或20µM的工作液。
3．Taq酶的用量
在100µl反应液中，一般加入2.5U的酶量，足以达到每分钟延伸1000~4000个核苷酸的掺入速度。酶量过多导致产生非特异性产物。但是不同的公司或不同批次的产品常有很大的不同。由于酶的浓度对PCR反应影响极大，因此应当进行预实验。一般100µl反应混合物用2~4U酶较为合适。
4．反应缓冲液
用于PCR的标准缓冲液含：50mM KCl,10mM HCl（pH8. 3,室温）和1 用于PCR的标准缓冲液含：50mM KCl,10mM HCl（pH8.3,室温）和1.5mM MgCl2。Mg2+的浓度对反应的特异性及产量有显著影响。浓度过高，反应特异性降低，浓度过低，使产物减少。在各种单核苷酸浓度为200µM时，Mg2+为1.5mM较合适。若样品中含EDTA或其它螯合物，可适当增加Mg2+的浓度。在高浓度DNA及dNTPs条件下进行反应时，也必须相应调节Mg2+的浓度，一般以1.5~2mM（终浓度）较好。
5．dNTP的浓度
高浓度dNTP易产生错误掺入；而浓度过低，则降低反应产物的产量。PCR常用终浓度为50~400µM的dNTPs。四种脱氧三磷酸单核苷酸的浓度应相同。如果其中任何一种的浓度明显不同于其它几种时，就会诱发聚合酶的错误掺入作用，降低合成速度，过早终止延伸反应。此外，dNTPs能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。因此，dNTPs的浓度直接影响到反应中起重要作用的Mg2+浓度。 三 实验器材、试剂及材料 1．实验器材
TC-512 PCR仪、超净工作台、台式离心机、微量加样器、核酸电泳仪、电泳槽、冰箱、紫外透射仪、0.2ml离心管、一次性手套 2．实验试剂
dNTP、Taq酶、模板质粒DNA、引物、10×PCR缓冲液、无菌H2O、电泳加样缓冲液、琼脂糖、1×TAE缓冲液 四 实验步骤 1．在0.2ml 离心管依次加入下列反应产物：
将上述试剂在微量离心管中仔细混匀，尽量避免产生气泡。置于离心机上迅速离心片刻。 2．在PCR仪上设定以下程序：
94℃变性5min，1个循环
94℃变性1min；55℃退火1min；72℃延伸1min；30个循环
72℃延伸10min，1个循环 五 注意事项 3．将样品置于PCR仪上进行扩增 五 注意事项
1．PCR反应应该在一个没有DNA的干净环境中进行
2．所用的所有溶液都应该没有核酸和核酸酶的污染。
3．所有PCR试剂中使用的水都应该用新鲜蒸馏的去离子水高压灭菌后分装备用。
4．所有试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和离心管，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。
5．PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。
6．扩增反应应设不加模板的阴性对照。 六 思考题
1．PCR反应体系中包括哪些成分？
2．设计引物时应遵循哪些原则？
3．可以采取哪些方法来提高PCR扩增产物的特异性？
4．PCR技术的应用范围？
实验五 大分子DNA的制备 一 实验目的
掌握植物DNA提取的基本步骤 二 基本原理
一般生物基因组DNA组107-8bp,制备基因组DNA是研究基因结构和功能的重要步骤，如大分子量DNA用于构建基因文库或基因组Southern分析，通常要求得到片断的分子量为100~200kb;如用于构建柯斯（cosmid）质粒文库，还需要更大的DNA。而制备人工染色体，如细菌人工染色体文库（bacteria artificial chromosome,BAC）和酵母人工染色体文库（yeast artificial chromosome,YAC），就必须得到平均数百万碱基对大小的片段，以便用限制性内切酶部分酶切后得到平均大小为200~500kb的片段。通常要求大分子DNA的分子量为克隆片段长度的4倍以上，否则会由于制备过程中随机断裂的末端多为平末端，导致酶切后有效末端太少，可用于克隆的比例太低，严重影响克隆工作。
有效制备大分子DNA的方法都要考虑两个原则：（1）防止和抑制内源DNase对DNA的降解；（2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。几乎所有DNase都需要Mg2+或Mn2+为辅助因子，故实现（1）的要求，只需加入一定浓度的螯合剂，如EDTA，柠檬酸，通常10~100Mm（视材料）。为实现（2）则当DNA处于溶解状态时，要尽量减弱溶液的涡旋，动作一定要轻柔，在进行DNA溶液转移时用大口（或剪口）吸管。
下面所介绍的方法，是一种通用的方法。特别适合于难于破碎和材料中蛋白含量高的情形；并且有以下几个优点：（1）在液氮冷冻条件下研磨破碎，保证材料在此过程中各种DNase无法活动。（2）破碎过程中DNA存在于细胞核中且呈固态，不受液体剪切力作用，既是细胞核破碎，导致断裂的程度也远低于通常的要求（即大于等于200kb）。（3）由于对组织破碎程度可以很高且均匀，故当加入含螯合剂的提取液后，DNase所需要的Mg2+等尚未开始作用已被鳌合剂掩盖。（4）加入的去污剂一方面可以破坏细胞膜，使大分子DNA释放到提取缓冲液中，另一方面也可以保护DNA受内源核酸酶的降解。
植物材料由于DNase水平低，蛋白含量也低，其操作要点是要避免植物次生代谢物质（如多酶，类黄酮等），植物多糖与DNA的共存，以保证DNA实现正常酶切等操作。针对这些特点，CTAB法可有较好的结果。 三 实验器材、试剂及材料 1．实验仪器
高速冷冻离心机；恒温水浴；紫外可见光分光光度计；核酸电泳设备。剪口枪头；1.5ml Eppendorf 管 2．实验试剂
A．2ⅹCTAB buffer：2g/100ml CTAB，1 A．2ⅹCTAB buffer：2g/100ml CTAB，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA, 100mmol/L Tris·Cl（pH8.0）
B．TE:（10mmol/L Tris，1mmol/L EDTA）（pH8.0）：1ml pH8.0的1mol/LTris·Cl缓冲液与0.2ml pH8.0的0.5mol/L EDTA溶液混合后，用重蒸水定容100ml而成。
C．β-Me
D．氯仿/异戊醇：将氯仿与异戊醇24∶1（v/v）
E．异丙醇
F．70%乙醇
G．RNase A
H．无水乙醇
J．3M乙酸钠 3．实验材料
油松针叶 四 实验步骤
1．水浴（65℃）加热CTAB buffer。
2．取植物叶片，称重。
3．将叶片置于研钵中，加入液氮，充分研磨至粉末状后，转移到50ml离心管中。
4．在管中加入65℃的CTAB buffer （1g：15ml）和2%V的β-Me，与粉末充分混匀（关键）。
5．65℃水浴保温一小时以上，中间温和混匀几次。
6．待混合物冷却至室温后，加入等体积的氯仿，颠倒混和10min 左右。
7．室温下5000g（或8000r）离心10min ，取上清。
8．再加氯仿/异戊醇抽提一次。
9．直到蛋白层不明显时，取上清，加2/3 V 的异丙醇。
10．有线状沉淀则挑出，无则离心。
11．用2ml 70%乙醇10000g （14000r）离心洗涤以去除盐（可置-20 ℃冰箱过夜）。
12．倒去70%乙醇，37℃干燥（20min），溶于600μl TE缓冲液，转移至1.5ml Eppendorf管中。
13．加入5μlRNase A（10mg/ml），37℃保温30min（可在-20 ℃冰箱中过夜）。
14．用等体积氯仿/异戊醇（24:1）抽提1~3次（视材料等情况而定）。
15．离心（10000 rpm ，5 min ，室温），吸取上清。
16．上清中加入1/10 V 3M NaAc（终浓度0.1~ 0.4M）, 加入2倍体积无水乙醇，室温放置10~20min 后，离心（10000rpm ，5min），沉淀DNA。
17．沉淀用70% 乙醇（-20 ℃）洗涤2 － 3次，37℃保温箱中干燥后，溶于适量TE buffer中。
18．测定DNA溶液在260nm和280nm光吸收值，计算OD260/OD280此值应大于1. 7如果小于1 18．测定DNA溶液在260nm和280nm光吸收值，计算OD260/OD280此值应大于1.7如果小于1.7，则说明含较多的蛋白。OD260/OD235 应大于1.7，小于时含有小分子杂质。
得率计算：1 OD260DNA为50ug/ml，因此公式为：OD260 X 50 X溶解体积/组织鲜重
19．检测：0.8%琼脂糖凝胶进行恒压电泳（电压5V/cm） 五 注意事项
基本注意事项见“基本原理” 六 思考题
1．如何检测和保证DNA的质量？
2．为什么构建DNA文库时一定要用大分子DNA？
3．基因组凝胶电泳时琼脂糖浓度一般为多少，为什么？
4．提取缓冲液中β-巯基乙醇的作用是什么？
实验六 Southern杂交 一 实验目的
1．掌握Southern杂交的技术原理。
2．掌握探针的制备技术
3．掌握Southern杂交的基本操作步骤 二 实验原理
Southern杂交又称DNA印记杂交，是指利用毛细管作用，将变性DNA从凝胶上转移至硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，加以固定后用探针杂交的技术。此法是由Dr,Southern1975年建立的,通过对特异性探针结合的基因组DNA片段内或其周围序列进行限制性内切酶酶切位点作图来研究基因在基因组内部是如何组织排列的。它是分子生物学研究领域中最常用的技术之一，为后来发展的各种生物大分子杂交技术提供了重要的理论和实践基础。 1．基本原理
分子杂交技术是根据二条单链DNA（或DNA与RNA）中互补碱基序列能专一配对的原理进行的。在一定条件下，单链DNA或RNA能与另一条单链DNA互补的碱基形成氢键，从而使两条单链杂交成双链DNA分子。
Southern印记杂交技术是由：电泳，印迹，固定和检测4个步骤组成。即用一种或几种限制性内切酶消化DNA分子，通过琼脂糖凝胶按分子量大小分离所得片段，随后使DNA在原位发生变性，并从凝胶中转移至一固相支持物的过程中，各个DNA片段的相对位置保持不变，用放射性标记或非放射性标记的DNA或RNA探针与固定于膜上的DNA分子进行杂交，经放射自显影或显色反应确定所有与探针杂交的片段的位置。
Southern杂交对样品的要求
用于Southern杂交的植物DNA样品在纯度、长度、及浓度上均应达到一定的要求。纯度上应无蛋白质、RNA、多糖及抑制限制性酶切的杂质，如酚类物质、丹宁、类萜、色素等，并无提取时所用试剂如酚及盐离子的残留。在长度上不应低于50kb,浓度应在0.5~1ug/μl之间。
探针很难直接与琼脂糖中的DNA进行杂交，因此必须把DNA转移至一固相支持物中，DNA在高盐存在下可以通过毛细作用印迹到膜上（目前又发展了真空转移和电转移等技术）。DNA片段的大小对转移效率有很大影响，大的DNA片段较难定量转移，一般可以用短波长紫外照射凝胶，将其中的DNA断裂为较小的片段，以利转移。实验表明，单链DNA的平均长度在大约1000个碱基时即可充分转移。
能产生可检测杂交信号所需的DNA量取决于几个因素：DNA中与探针互补部分所占比例，探针大小与比活，膜上DNA的量。在最佳条件下经放射自显影曝光数天后这一方法的灵敏度足以检出不到0.1pg的与高比活32P标记的探针（109cpm/μg）互补的DNA。Southern印迹杂交方法通常需要10μg基因组DNA。
杂交所用探针一般多采用放射性同位素标记，但由于非放射性探针标记对人体无害，无同位素污染及其后处理等优点，此外，标记的探针可长期保存，随时可用，所以非放射性探针标记越来越受到重视。
非放射性地高辛标记技术是指利用地高辛（digoxigenin,DIG）（一种半抗原）标记DNA、RNA或寡聚核甘酸探针，以便进行杂交及随后的显色或化学发光检测。
非放射性探针标记方法之一是采用由间臂连接有类固醇半抗原的异羟基泽地黄毒甘配基标记的dUTP（缩写DIG-dUTP）作为DNA合成的底物，经随机引物标记法掺入新合成的DNA中，形成非放射性同位素标记探针，杂交后，用相应的碱性磷酸酶联抗体检测DIG标记DNA的存在。在X-磷酸盐和消基蓝四唑盐（NBT）存在下，碱性磷酸酶催化生色反应，显示出所检测的目标DNA所在。
对DNA标记来说，DIG通过一个不耐碱的酯键与dUTP相连。使用不耐碱的DIG-11-dUTP可以更容易和有效地除去膜上的探针，利用第二种DIG标记的探针进行再杂交，不耐碱的DIG-11-dUTP标记的DNA探针不能用碱（NaOH）变性，必须在沸水中保温变性。
DNA标记：DIG-High Prime系统是以随机引物标记的原理标记DNA探针。在5X反应缓冲液中预先混合了随机引物标记的所有试剂，既可以节省步骤又可以提高产量和可重复性，十分方便。DIG-High Prime系统可以用小到200bp的 DNA片段，线性化的质粒、粘粒或λDNA甚至超螺旋的质粒作为标记的模板。
DIG-High Prime标记反应的产量：在标准反应中37度保温1小时，由1μg的对照DNA可以产生800ng的DIG标记的DNA，标记片段的长度为200~1000bp.
杂交：有别于同位素标记的杂交反应，使用DIG Easy Hyb（一种可以立即使用的无毒的杂交液），可以将杂交时间降到低于4小时。
免疫检测：杂交后的探针与偶联有碱性磷酸酶的抗体（anti-DIG-AP）结合，然后用显色底物NBT/BCIP或化学发光底物CSPD检测与DIG结合的抗体。 2．Southern 杂交的应用
以特定的已知核苷酸序列做探针，在诸多的核苷酸序列中，通过杂交探测出与其互补的序列，因而分子杂交是进行核苷酸序列分析，重组子鉴定以及检测外源基因整合及表达的强有力的手段。 三 实验器材、试剂及材料
1．实验器材：杂交箱；THZ-82型恒温振荡器；稳压电泳仪；电泳槽；紫外检测仪；电热恒温水浴锅等；保鲜膜，杂交筒，吸水纸，解剖刀，增感屏，瓷盘，镊子，手套，滤纸，硝酸纤维素膜和尼龙杂交膜。
2．实验试剂：
（1）罗氏（Roche）公司DIG High Primer Labeling and Dection Starter Kit I成分
（2）0.2M EDTA,pH8.0
（3）4M LiCl
（4）无水乙醇
（5）70%乙醇
（6）TE缓冲液
（7）封闭试剂
DIG Wash and Block Buffer Set 中的10 x 封闭溶液
10x SSC：0.15M NaCitrat,1.5M NaCl pH7.0
SDS 10%
（8）标准杂交缓冲液
5x SSC
N-lauroylsarcosine,0.1%（w/v）
SDS, 0.02%（w/v）
1/10 体积的封闭溶液，10 x
（9）DIG Wash and Clock Buffer Set
含有10x 马来酸缓冲液，10 x封闭溶液，10 x检测缓冲液。
缓冲液1：马来酸缓冲液（maleic acid buffer）
0.1M maleic acis, 0.15M NaCl;用固体NaOH将pH调到7.5
洗膜溶液（washing buffer）
马来酸缓冲液加入0.3%Tween 20（v/v）
缓冲液2：封闭溶液
将十倍浓度的封闭溶液用马来酸缓冲液稀释十倍
缓冲液3：检测缓冲液
0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 50mM MgCl2, pH9.5
缓冲液4：TE缓冲液
10mM Tris-HCl,1mM EDTA, pH8.0
（10） 显色溶液
必须新鲜配置：在10ml缓冲液3中加入200 µl NBT/BCIP 浓储备液
（11）采用Promega公司“primer-a-gene” labeling kit 和DIG-dUTP进行探针标记
（12）定影液和显影液 ３．实验材料
样品DNA；DIG-DNA探针 四 实验步骤 （一）Southern转移
1．将样品DNA酶切过夜，0.8%琼脂糖凝胶上电泳过夜，取出凝胶在紫外灯下照相
2．将胶置于含0.5M NaOH, 1.5M NaCl的变性液中变性40min,中间更换一次变性液。
3．置于含1M Tris-HCl （pH7.4）, 1.5M NaCl的中和液内中和40min, 中间更换中和液一次。
4．刀去除多余部分，在加样孔端切去一角，以示胶的方位。
5．将电泳胶板倒扣在白磁盘中，上面放上一张滤纸，倒入20xSSC，用玻璃棒赶走气泡。
6．剪一张四周比胶大1mm的尼龙膜（Immobilon-Ny+尼龙膜 （Millipore公司），用6xSSC浸湿 5min。
7．将胶反转置于平台上，赶走气泡
8．用parafilm 膜围绕胶的四周，防止短路。放上一叠5~8cm厚的纸巾，上压一重物
9．通过毛细作用将DNA转移至上，毛细管法转移过夜。
10．尼龙膜用铅笔标记加样孔，2×SSC浸泡5min，室温干燥30min。80℃烤膜1.5~2h固定DNA。
1．利用低熔点胶回收目的片段；
（1）制备1%普通琼脂糖凝胶，切割一定位置的胶条，倒入配制好的尚未凝固的低熔点胶，形成混合胶板用于回收目的片段。
（2）20µl酶切反应物，65℃热变性5分钟后，置于冰上5分钟。
（3）加入4µl 6x 加样指示剂，将全部25µl加入1%普通琼脂糖电泳胶孔中，1-5V/ cm电场强度下电泳，直至目的片段 完全进入1%低熔点胶中。
（4）切下载有目的片段的低熔点胶，加入等体积的TE缓冲液，0.1体积3M NaCl, 65℃保温至其中低熔点胶完全熔化。
（5）加入预热的等体积酚，再保温5分钟，
（6）离心取水相，再用酚和酚：氯仿抽提至液面干净。
（7）加入2倍体积的无水乙醇，-80℃沉淀半小时以上。
（8）12000g离心十分钟回收DNA
（9）70%乙醇洗涤沉淀，真空干燥。
2．随机引物末端标记目的片段（Promega公司 Primer-a-gene Labeling System）
（1）将目的片段溶解于TE缓冲液中，浓度为1-25µg/ml
（2）在反应管中加入1µg模板DNA，用无菌的双蒸水将体积加到16µl。
（3）将DNA 在沸水中加热10分钟变性，迅速放在冰上。
（4）加入4µl DIG-High Primer 混合，稍微离心。
（5）37℃保温1到20小时
（6）加入2µl 0.2M EDTA（pH8.0）或65℃加热10分钟终止反应。 （三）DNA分子杂交
（1）将适当体积（20ml/100ml）的杂交缓冲液或DIG Easy Hyb预热到杂交温度，将膜保温30分钟，温和搅动，进行预杂交。
（2）将DIG标记的探针（5~25ng/ml）杂交液）在沸水中变性5分钟，在冰水上迅速冷却。
（3）加到预热的杂交缓冲液或DIG Easy Hyb（2.5ml/100cm2）中，充分混匀。
（4）倒去预杂交液，换上探针和缓冲液的混合物，温和搅动，保温至少6小时，
如检测低丰度靶DNA中的单拷贝基因，建议保温16小时，杂交温度为65℃。 （四）杂交后洗膜
（1）在室温下用2 x SSC，0.1%SDS 洗2次，每次5分钟。
（2）在65℃用0.1 x SSC, 0.1%SDS洗2次，每次15分钟，不停搅动。 （五）免疫检测
（1）杂交及严格洗膜后，将膜在马来酸缓冲液中稍微漂洗1~5分钟。
（2）在100ml封闭溶液（1 x）中孵育30分钟
（3）在封闭溶液（1x）中将anti-DIG-AP稀释到150mU/ml（1:5000）
（4）配制20ml抗体溶液
（5）膜在20ml抗体溶液中孵育30分钟。
（6）用100ml洗膜溶液（washing buffer）洗两次，每次15分钟。
（7）在20ml检测缓冲液中平衡2~5分钟
（8）将10ml新配的显色溶液与膜一起置于塑料袋或盒，封闭，并在黑暗中温育。
（9）当点或带显色到合适的深度后，将膜用50ml去离子水或缓冲液4洗5分钟后终止反应。将湿膜复印或照相做记录。 五 注意事项
1．杂交温度不可过高，时间不宜过长；杂交温度应比杂交分子的解链温度低20~25℃。一般同源探针的杂交温度在65℃。异源探针的杂交温度应适当调低，一般可在50℃下进行杂交。
2．洗膜的严紧性：应尽量控制洗膜的严紧性以降低背景，如用放射性标记应在洗膜的过程中密切监测放射性强度，以防过高的严紧度致使探针脱落。
3．硝酸纤维素膜与尼龙膜相比，易碎，操作时应注意；
4．杂交膜不立即进行杂交，滤膜可放到密封的杂交袋中长期保存。 六 思考题
1．放射性同位素标记与非放射性探针标记各有哪些优缺点？
2．影响杂交效率和稳定性的因素有哪些？
3．在进行凝胶电泳时，如果电泳条带靠近加样孔的一端比另一端亮的多，可能的原因是什么？
4．杂交后没有信号出现的原因有哪些？
实验七 RNA的制备及Northern杂交分析 一 实验目的
1．掌握植物RNA提取的基本步骤
2．掌握甲醛变性凝胶电泳的技术
2．掌握Northern 杂交的基本技术 二 基本原理
制备高纯度且完整的RNA是进行Northern分析、mRNA纯化、cDNA合成及体外翻译等实验的必要前提，是研究基因表达在转录水平上的调控的重要环节。一般1克动物组织约含有1毫克RNA，植物材料含量低些。其中大部分为rRNA，约15%为tRNA，只有1~5%左右为mRNA。
基因的转录产物RNA是4种核糖核苷酸（ATP、UTP、GTP、CTP）的单链聚合物。它在水溶液中的稳定性很低。由于2-OH的存在， RNA分子可自发水解，特别在强碱性条件下很容易通过2-OH形成2,3磷酸二酯（环），而后进一步水解成2-核苷酸和3-核苷酸。
RNA分子的不稳定性还源于RNase的特点。RNase为较小的单肽链蛋白（约120aa），具有较多的二硫键（4对）。这使得RNase的结构特别紧凑，100℃处理20分钟不能灭活，高压灭菌条件也不会使之变性。另外，RNase对RNA的降解作用通过2-OH进行，不需要二价金属离子的参与，因而金属离子螯合剂（如EDTA）无法抑制它的活性。
由于RNase的高稳定性、广泛存在性和RNA自身的不稳定性，在有关RNA操作的实验中需要注意以下问题：（1）必须采取强烈的处理条件以抑制内外源RNase的活性。对于外源RNase，通常使用能够强烈抑制蛋白质活性的试剂，如DEPC（焦碳酸二乙酯）、碘乙酸水溶液、氯仿等处理要用到的塑料器皿，如离心管、Tip头等可用0.1%DEPC水37℃浸泡12小时以上，高压灭菌并烘干后使用。玻璃器皿经180℃烘烤12小时以上，冷却备用。所用溶液用0.1%DEPC 37℃处理12小时以上，经高压灭菌后于4℃保存。对于内源RNase的抑制，则根据实验特点采取不同方法。如体外转录等实验，可加入RNase的专一抑制剂（RNasin）。对于RNA的分离制备可采用非特异性的蛋白变性剂。另外，操作时要保持空气清洁,尽量减少空气流动，接触可能污染RNA酶的物品后要更换手套。（2）针对RNA的不稳定性，通常采取快速和低温的策略，尽量减少RNA的降解。
提取RNA的方法有多种（如Promega公司：RNAgents Total RNA lsolation System所提供的方法），本实验采用常用的异硫氰酸胍-巯基乙醇联合变性的方法，巯基乙醇使RNase的二硫键被还原打开，异硫氰酸根和胍离子都是很强的蛋白质变性剂，使得RNase分子肽键伸展，失去有序的高级结构，而失去活性。
Northern吸印转移技术是将RNA分子在变性琼脂糖凝胶中按其大小不同而相互分开，随后转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，用放射性标记的DNA或RNA探针进行杂交和放射自显影。这一技术可以测定总RNA或Poly(A)+ RNA样品中特定mRNA分子的大小和丰度，是研究基因转录产物的重要手段。
RNA通常为单链结构，使得其电泳分析与DNA有所不同。
（1）RNA电泳须克服单链RNA分子中不同区段碱基配对形成一定高级结构而造成电泳迁移率与分子量不成负对数关系这一问题。
（2）RNA电泳过程应始终抑制RNase活性。
为了解决上述两个问题，RNA电泳常采用变性甲醛琼脂糖凝胶来进行。在近中性电泳系统中加入适当浓度甲醛（0. 66~2 为了解决上述两个问题，RNA电泳常采用变性甲醛琼脂糖凝胶来进行。在近中性电泳系统中加入适当浓度甲醛（0.66~2.2M）有助于抑制RNase活性；甲醛由于能够与碱基形成具一定稳定性的螯合物，而阻止碱基配对；同时，甲醛能与多肽链中的亲核基团如：ε-胺基、胍基、巯基起化学反应，使酶分子失去活性。另外，使RNA电泳系统离子强度尽可能低也有助于消除碱基配对。
由于细胞中mRNA在总RNA中含量很低，如E 由于细胞中mRNA在总RNA中含量很低，如E.coli中mRNA为3%，而rRNA约90%，tRNA约7%，这样高丰度的rRNA和tRNA易与放射性探针部分配对或非特异结合而造成假阳性干扰，甚至导致Northern分析的失败。关于这个问题有如下解决办法：（1）严格充分的预杂交对消除rRNA的干扰有一定效果。如果检测的是外源基因的转录水平可将检测物种本身的DNA用于预杂交液中，这样由于同源性一致，内源的RNA包括rRNA可为同物种DNA所封闭。（2）对于内源基因产物检测可预先分离mRNA，但应注意并非所有真核生物mRNA都有polyA结构；（3）认真选取与rRNA序列同源性极低的探针；（4）采用尽可能严谨的杂交条件，如提高杂交温度或增加甲酰胺含量。 三 实验器材、试剂及材料 1．实验器材
匀浆器或研钵，离心机，电泳槽、电泳仪，振荡器，制冰机，杂交仪，烤箱等。 2．实验试剂
（1）CSB缓冲液
42mmol/L 柠檬酸钠（Sodium citrate）
0.83%（W/V）十二烷基肌氨酸钠（N-lauryl sarcosine）
0.2mmol/L巯基乙醇（-mercaptoethanol）（使用前加入）
（2）异硫氰酸胍变性匀浆液
异硫氰酸胍（4M）（guanidine isothiocyanate）25g
CSB缓冲液33ml
混合，终体积约50ml, 完全溶解后4℃保存备用
（3）2mol/L乙酸钠（pH4.0）0.1%DEPC处理
（4）水饱和酚：采用RNase-free ddH2O饱和的重蒸酚
（5）氯仿:异戊醇（24:1）
（6）无水乙醇
（7）75%乙醇：用RNase-free ddH2O配制
（8）异丙醇
（9）RNase-free水：1ml DEPC溶于1000ml ddH2O（过夜），高压灭菌（121C, 30min）
（10）焦碳酸二乙酯（DEPC）
（11）琼脂糖
（12）10MOPS: 0. 2M MOPS（pH7. 0），80mM乙酸钠，10mM EDTA（pH8. 0）。将20 （12）10MOPS: 0.2M MOPS（pH7.0），80mM乙酸钠，10mM EDTA（pH8.0）。将20.6g MOPS溶于400ml经DEPC处理的100mM乙酸钠溶液。用2N NaOH将溶液的pH值调至7.0，加10ml经DEPC处理的0.5M EDTA（pH8.0），再加用DEPC处理的水至溶液总体积为500ml。上述溶液用0.2M微孔滤膜过滤除菌，避光保存于室温。
（13）37%甲醛
（14）溴化乙锭（EB：10mg/ml）
（15）去离子甲酰胺
（16）10 Loading buffer：50%甘油，1mM EDTA（pH8.0），0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青
（17）20 SSC：3M NaCl，0.3M柠檬酸钠
（18）硝酸纤维素膜或尼龙膜 3．实验材料
植物花芽 四 实验步骤 1．RNA的分离与纯化
（1）取1g植物花芽，液氮研磨，室温置片刻，使液氮挥发。
（2）将研磨后的材料加入预冷的含12ml变性匀浆液的50ml 离心管中，剧烈混匀。
（3）加入1.2ml 2M 乙酸钠（pH4.0）充分混合,以调节体系pH值至酸性。
（4）加入8ml水饱和酚（不用Tris饱和酚）， 4ml氯仿:异戊醇（24:1），混匀，在冰上放置30分钟，中间振荡数次。
（5）4℃，12000g离心20分钟。
（6）小心移取上层水相，弃去中间相和下层有机相。
（7）加入等体积酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），振荡10秒钟，冰上放置5分钟。
（8）4℃，12000g离心20分钟。
（9）移取上层水相，弃去中间相和下层有机相。
（10）重复7-9的操作至中间相消失。
（11）加入等体积异丙醇，放置-20℃至少30分钟以沉淀RNA。（过夜则沉淀更加充分）
（12）4℃,12000g离心15分钟收集RNA沉淀。
（13）用75%乙醇洗涤沉淀。
（14）将RNA沉淀在空气中干燥。注意不应完全失水。
（15）用50μl RNase-free ddH2O溶解RNA沉淀（可短时65℃水浴助溶）。
（16）溶解的RNA可在-70℃保存，或用于RNA电泳。
所有用于配制与RNA相关的溶液的水需预先经DEPC处理。
（1）选定合适的琼脂糖凝胶浓度：
RNA甲醛变性凝胶浓度通常为1~1.5%。浓度高有利于提高对小分子量mRNA分辨率，浓度低则有利于转移。如欲检测的mRNA分子量较小（<2kb），可采用浓度为1.5%的琼脂糖凝胶。
（2）制胶：
配制1%凝胶100ml采用下述配方：取1.0g Agarose, DEPC H2O 72ml, 100℃熔化Agarose。冷却至50~60℃，加入10 MOPS 10ml, 37%甲醛溶液18ml及5l EB（10mg/ml）。
（3）适当放置冷却，45℃左右倒胶于放好梳子的电泳胶板上。
（4）胶凝好后，电泳槽中加入适量1 MOPS电泳缓冲液（若通风柜条件好，可在电泳缓冲液中也加入相应浓度甲醛）待用。
3．RNA电泳
（1）RNA样品混合液的制备：
在一经DEPC处理的微量离心管内混合下列成份：
（2）65℃变性10min-15min, 立即冰浴5min, 离心5秒钟。
（3）加2.5l Loading Buffer 混匀，离心5秒钟，置于冰上。
（4）5V/cm电压降预电泳5分钟，上样。
（5）3~4V/cm开始电泳。RNA与溴酚兰一样向阳极移动。
（6）每30分钟停止电泳，迅速取出胶板，将两极电极液混匀一次，放回胶板，继续电泳。
（7）溴酚兰移动约8cm停止电泳，放置标尺并照像。以RNA分子量标准或材料内源rRNA作为分子量参照。若条带不够清晰，可先将电泳胶在0 （7）溴酚兰移动约8cm停止电泳，放置标尺并照像。以RNA分子量标准或材料内源rRNA作为分子量参照。若条带不够清晰，可先将电泳胶在0.01×SSC中浸泡15~20分钟，除去大部分甲醛后再照相。
4．凝胶印迹转移
（1）照相后，将凝胶用经DEPC处理的水淋洗数次以除去甲醛。
（2）如果琼脂糖凝胶厚度大于0. 5cm或待分析的RNA大于2. 5kb，需用0 （2）如果琼脂糖凝胶厚度大于0.5cm或待分析的RNA大于2.5kb，需用0.05M NaOH浸泡凝胶20分钟，以部分水解RNA并提高转移效率。
（3）用无RNA酶的水淋洗凝胶，并用20×SSC浸泡凝胶45分钟
（4）用20×SSC作转移液，把RNA转移至尼龙膜上（同Southern杂交）。
（5）转膜结束后，在2×SSC中漂洗并晾干，80℃烘烤2小时，使RNA牢固结合于膜上，也使之不再对RNase敏感。
5．预杂交和杂交（同Southern分析）。 五 注意事项
RNA制备方法已报道了不少种，本实验采用了比较常用的异硫氰酸胍法。如果操作得当，该方法制备的RNA应无DNA和蛋白质的污染。RNA样品的纯度及完整性可由OD260/OD280的值和琼脂糖变性凝胶电泳来检测。较纯的RNA样品OD260/OD280通常为2.0，若该比值偏低，应进一步纯化。真核生物RNA样品电泳图谱28S和18S的比值约为2:1，否则，表明有RNA降解，因为28SrRNA可特征性地降解为类似18S的RNA。RNA样品的浓度可由OD260推算而来，如OD260＝1，则RNA样品的浓度约为40g/ml。
在实验过程中，如毋须回收或转膜，可通过常规的0.7%琼脂糖凝胶电泳快速检测所提RNA样品的质量。
实验中还应注意以下几点：
1．为避免RNA酶的污染，提取RNA所有的试剂和用具物品必须是专用的。
2．戴手套进行操作，RNA提取过程应在冰上进行，以尽可能减少RNA的降解。
3．焦碳酸二乙酯（DEPC）有致癌的嫌疑，应小心操作。处理之后的物品应通过高压灭菌使DEPC分解。 六 思考题
1．提取RNA时为什么要始终带手套操作？
2．RNA提取的主要步骤有哪些？
3．如何检测或评价RNA的质量？
4．如何确定RNA的浓度？ 附：一、胡萝卜体细胞胚总RNA电泳照片 二、不同种类RNA对应的核酸分子大小
参考文献
1．萨姆布鲁克 J, 弗里奇 E F, 曼尼阿蒂斯 T. 分子克隆实验指南（第二版） 科学出版社。
2．《分子生物学实验指南》，魏群主编，高等教育出版社和施普林格出版社
3．（英）Clark MS 主编，顾红雅，瞿礼嘉主译，陈章良主校，植物分子生物学实验手册。高等教育出版社
4．梁国栋主编，最新分子生物学实验技术。科学出版社。
5．中国科学院遗传与发育生物学研究所植物分子生物学实验指导书