学 院 生命科学学院 专业班级 2007级生物技术4班 学生姓名 徐 志 超 指导教师 高 玉 千 常用的五种基因测序仪器的比较 学 院 生命科学学院 专业班级 2007级生物技术4班 学生姓名 徐 志 超 指导教师 高 玉 千

主要内容 三代测序技术简况 五种测序仪器的原理和特性 五种测序仪器的比较

以实验方法和实验仪器的改进为标志DNA测序技术迄今经历了三代的发展 代数 测序技术 特点 代表仪器 第一代 sanger测序法 低通量，高成本 ABI 3730XL 第二代 循环芯片技术 高通量 高效率 成本底 Illumina GA ROCH-454 ABI-SOLID 第三代 单分子测序 试剂用量少，成本更低 HeliScope

一、测序仪之——ABI 3730XL ABI 3730XL的测序原理 sanger 法： 毛细管电泳分离 电脑荧光检测 数据分析可得到DNA碱基序列。

2. ABI 3730xl特性 通过几十年的逐步改进, ABI 3730xl测序仪的读长可以超过1000 bp, 原始数据的准确率可以高达99.999%测定每千碱基序列的成本是 0.5 美元, 每天的数据通量可以达到 600 000 碱基 但是ABI 3730xl测序技术在速度和成本方面都已达到了极限. 由于其对电泳分离技术的依赖,使其难以进一步提升分析的速度,并且难以通过微型化降低测序成本. 尽管如此, ABI 3730xl的方法可靠、准确,且已形成规模化, 特别是在 PCR 产物测序、质粒和细菌人工染色体的末端测序、以及STR基因分型方面,将继续发挥重要作用.

二、测序仪之——ABI SOLID ABI SOLID的测序原理： 制备DNA文库 乳液PCR/微珠富集

探针的5′末端标记了1种颜色的荧光染料。探针3′端1～5位为随机碱基，其中第1、2位构成的碱基对表征探针染料类型，而3～5位的“n”为随机碱基，6～8位的“z” 是可以和任何碱基配对的特殊碱基。SOLiD测序反应的每一轮测序反应会连接第1~5位的碱基，同时切除第6~8位的碱基，同时记录下第1~2位碱基决定的荧光颜色，

SOLID的双碱基编码矩阵 两个碱基共同决定一个颜色，可以极大的提高测序的准确率

五轮测序反应反应后，按照第0、1位，第1、2位... …的顺序把对应于模板序列的颜色信息连起来，就得到由“0，1，2，3…”组成的SOLiD原始颜色序列。

2. ABI SOLID的特性 无以伦比的通量 目前SOLiD 3系统单次运行能产生50 GB的人基因组序列数据，相当于基因组的17倍覆盖度，这显然是其他任一台新一代测序系统都无法达到的 准确性。 新的超精确检测模块（ECC模块）将提供高达99.99%的精确性；多达98%的可定位碱基的质量值高于45；更多标签以提高灵敏度和动态范围；高准确性的原始读序，支持无参考序列的数据分析。

三、测序仪之——Illumina Genome Analyze Illumina GA的测序原理 制备DNA文库 桥式PCR产生DNA簇 测序 加入DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP。 每个循环掺入单个碱基。用激光扫描反应板表面，读取所聚合上去的核苷酸种类。之后，将这些基团化学切割，恢复3′端粘性，继续聚合第二个核苷酸。如此继续下去，直到每条模板序列都完全被聚合为双链。这样，就可以得知每个模板DNA片段的序列。

桥式PCR

2. Illumina GA的特性 1. 可扩展的超高通量 Genome Analyzer系统目前每次运行后可获得超过20 GB的高品质过滤数据。经优化后通量还有望上升到95 GB，相当于人类基因组的30倍覆盖度。 2. 需要样品量少 Genome Analyzer系统需要的样品量低至100ng，能应用在很多样品有限的实验（比如免疫沉淀、显微切割等）中。 3. 简单、快速、自动化 Genome Analyzer系统提供了最简单和简洁的工作流程。制备样品文库可以在几小时内完成，一个星期内就能得到高精确度的数据。自动化的流程不减少了手工操作误差和污染可能性，也不需要机器人操作或洁净室。

四、测序仪之——ROCH-454 454测序原理及流程 文库制备 乳液PCR扩增 焦磷酸测序

乳液PCR扩增 焦磷酸测序

2. ROCH-454的优势 454平台的突出优势是读长。目前454系统的序列读长已超过400 bp。虽然454平台的测序成本比其他平台要高很多，不过对于那些需要长读长的应用，如从头拼接和环境微生物组学，它仍是最理想的选择。

五、测序仪之——HeliScope HeliScope 的测序原理 将基因组DNA切割成随机的小片段DNA分子，并且在每个片段末端加上poly-A尾 通过poly-A尾和固定在芯片上的poly-T杂交，将待测模板固定到芯片上，制成测序芯片 最后借助聚合酶将荧光标记的单核苷酸掺入到引物上。采集荧光信号，切除荧光标记基团，进行下一轮测序反应，如此反复，最终获得完整的序列信息。

2. HeliScope 的优势 单分子测序减少了试剂的使用，测序成本价格大大降低，使得人的基因组测序低于1000美元慢慢走向可能。 不需要扩增建立DNA库，从而切断数据结果中潜在错误的来源

五种测序仪器的比较 由上表可以看出，第二代和第三代测序仪由于消耗的试剂少在测序费用上有了明显的降低，但是在读长上3730xl依然具有绝对的优势，不过随着技术的完善，新一代的测序仪依然拥有极大的提升空间。

测序仪器 所采用测序技术 校错方法 高通量 优势方面 上市时间 3730XL 鸟枪Sanger测 序法 毛细管 电泳技术 主要用于KB～MB 级别的测序 常规测序， 高准确度 2002年 ABI SOLiD 微乳液PCR扩增 连接酶法测序 双碱基编码技术 最高可达180 GB 第二代测 序仪中准 确度最高 2007年 1月 Solexa GA 桥式PCR技术 合成测序法 通过质量优 化将错误率 降低到0.1% 可获得超过20 GB的高品质数据 检测同 聚物 ROCH-454 GS FLX 大规模并行焦 磷酸合成 测序法 每轮运行能获得4-6亿个碱基对 超长的读 长400bp 2005年 HeliScope 大规模并行单分子焦磷酸合成测序法 重新以反方 向再次 测序 目前测序读长较短 检测碱基 替换突变， 费用低 2008年 2月

如何选择合适的测序仪 测序的准确度和各自的优势的考虑：比如是善于发现插入、缺失突变还是善于发现碱基替换突变。 项目考量：比如重测序对于测序长度的要求没有从 头测序的要求高；对于需要依靠标签计数的测序项目，会更 加需要能将待测片段分割成尽量多、尽量小片段的测序方法。 费用考量：3730xl适用于对kb~mb长度的DNA片段 进行的小规模的测序项目。在测序长度和准确率方面具有优势，但在大规模测序项目中大家还是倾向于选择新一代测序仪，主要差距在于费用，新型测序仪能将测序费用降低几个 数量级。