第二节 细胞周期调控 一、MPF的发现及其作用 第二节 细胞周期调控 一、MPF的发现及其作用 MPF(卵细胞促成熟因子,matuation-promoting factor;细胞促分裂因子,mitosis-promoting factor;M期促进因子,M-phase-promoting factor)。 Johnson和 Rao(1970)将Hela细胞同步于不同阶段,然后与M期细胞混合,在灭活仙台病毒介导下,诱导细胞融合,发现与M期细胞融合的间期细胞产生了形态各异的早熟凝集染色体(prematurely condensed chromosome,PCC)。 G1期PCC为单线状,因DNA未复制;S期PCC为粉末状,因DNA由多个部位开始复制;G2期PCC为双线染色体,说明DNA复制已完成。
注射实验表明:孕酮诱导卵母细胞成熟;成熟卵细胞质中,含有卵母细胞成熟的因子,称做MPF 人M期细胞与袋鼠(Ptk)G1、S、G2期细胞融合诱导PCC:提示M期细胞存在诱导PCC的因子; 不同形态的PCC
不仅同类M期细胞可以诱导PCC,不同类的M期细胞也可以诱导PCC产生,如人和蟾蜍的细胞融合时同样有这种效果,这就意味着M期细胞具有某种促进间期细胞进行分裂的因子,即成熟促进因子(maturation promoting factor,MPF)。 早在1960s,Yoshio Masui发现成熟蛙卵的提取物能促进未成熟卵的胚胞破裂(Germinal Vesicle Breakdown,GVBD),后来Sunkara将不同时期Hela细胞的提取液注射到蛙卵母细胞中,发现G1和S期的抽取物不能诱导GVBD,而G2和M期的则具有促进胚胞破裂的功能,它将这种诱导物质称为有丝分裂因子(MF)。后来在CHO细胞,酵母和粘菌中也提取出相同性质的MF。这类物质被统称为MPF。 1988年Maller实验室从非洲爪蟾卵中纯化出MPF,证明主要含p32和p45两种蛋白,表现出激酶活性。
二、P34cdc2激酶的发现及其与MPF的关系 1960s L. Hartwell以芽殖酵母为实验材料,利用阻断在不同细胞周期阶段的温度敏感突变株(在适宜的温度下和野生型一样),分离出了几十个与细胞分裂有关的基因(cell division cycle gene,CDC),如芽殖酵母的cdc28基因,在G2/M转换点发挥重要的功能。Hartwell还通过研究酵母菌细胞对放射线的感受性,提出了checkpoint(细胞周期检验点)的概念,意指当DNA受到损伤时,细胞周期会停下来。 以P.Nurse为代表的另一批酵母生物学家研究不同温度下培养的裂殖酵母细胞,也分离出数十种温度敏感的突变体。这些不同的突变体在限定温度下,会滞留在细胞周期的某个阶段。这些与细胞分裂和周期调控有关的基因被称为cdc(cell division cycle)基因,根据被发现的先后顺序被命名。
cdc2是第一个被分离出来的cdc基因,表达34kDa的蛋白,称p34cdc2。进一步研究发现其具有激酶活性,可以使许多蛋白磷酸化,在裂殖酵母的周期调控中起重要作用。芽殖酵母中的一个关键cdc基因是cdc28,是第二个被分离出来的cdc基因,编码34kDa的蛋白,具有激酶活性。 p34cdc28是 p34cdc2的同原物,调控细胞周期,特别是G2/M期转变。但研究者很快发现, p34cdc28 或p34cdc2单独并不具有激酶活性,需要同相关蛋白结合后才具有活性(如p34cdc2和蛋白p56cdc13结合)。 之后,J.Maller和P.Nurse实验室立即合作,很快证明爪蟾卵中的p32与p34cdc2是同原物。与此同时,T.Hunt实验室等以海胆卵为材料研究细胞周期调控,发现一类与细胞分裂有关的蛋白,称为周期蛋白(cyclin)。然后J.Maller和T.Hunt实验室合作,发现周期蛋白B,证明与p45和p56cdc13为同原物。
2001年10月8日, L. Hartwell、P. Nurse、T. Hunt 因对细胞周期调控机理的研究而荣获诺贝尔生理医学奖。
三、周期蛋白 自发现周期蛋白后,在不长的时间里有数十种周期蛋白被克隆和分离。如酵母的Cln1,Cln2,Clin3,Clb1-Clb6,在脊椎动物的A1-2、B1-3 、C、 D1-3、E1-2、F、G、H等。各类周期蛋白均含有一段约100个氨基酸的保守序列,称为周期蛋白框,介导周期蛋白与CDK结合,不同的周期蛋白框识别不同的CDK,组成不同的周期蛋白复合体,表现不同的CDK激酶活性。 M期周期蛋白分子的近N端含有一段9个氨基酸组成的破坏框,参与泛素介导的周期蛋白A和B的降解。G1期周期蛋白分子的C端含有一段特殊的PEST序列,可能与G1期周期蛋白的更新有关。
周期蛋白分子结构特征
不同周期蛋白的表达时期不同,与不同的CDK结合,调节不同CDK激酶的活性。
四、CDK激酶和CDK激酶抑制物 在酵母cdc2和cdc28基因被分离后,几个实验室同时工作构建了人类、爪蟾和果蝇的cDNA文库,得到了一系列与cdc2相关的基因。他们有两个共同的特点,一是含有一段类似的氨基酸序列,二是都可以同周期蛋白结合。统称为周期蛋白依赖性蛋白激酶,CDK激酶。 已经命名的CDK激酶包括:CDK1-8。cdc2最早被发现,被命名为CDK1。各种CDK分子都含有一段类似的CDK激酶结构域,其中一段PSTAIRE的序列相当保守,与周期蛋白的结合有关。另外,一些位点的磷酸化与激酶的活性有关。 CDK激酶的效应是多方面的,如将核纤层蛋白磷酸化导致核纤层解体、核膜消失,将H1磷酸化导致染色体的凝缩等等。
与cdc2类似的CDK蛋白分子图解
细胞中还具有细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CDK inhibitor,CDKI)对细胞周期起负调控作用,目前发现的CDKI分为两大家族: ①Ink4(Inhibitor of cdk 4),如:P16ink4a、P15ink4b、P18ink4c、P19ink4d,特异性抑制cdk4·cyclin D1、cdk6·cyclin D1复合物。 ②CIP/Kip(Kinase inhibition protein):包括P21cip/waf1 (cyclin inhibition protein 1)、P27kip1(kinase inhibition protein 1)、P57kip2等,能抑制大多数CDK的激酶活性,P21cip/waf1还能与DNA聚合酶δ的辅助因子PCNA(proliferating cell nuclear antigen)结合,直接抑制DNA的合成。
五、细胞周期转运调控 周期蛋白激酶
周期蛋白激酶的活性
细胞周期调控示意图
裂殖酵母细胞周期的调控
人细胞周期的调控
(一)G2/M期转化与CDK1激酶的调控作用 CDK1激酶(p34cdc2激酶),由p34cdc2蛋白(或p34cdc28蛋白)与周期蛋白B组成。
CDK1激酶催化不同的底物(主要是磷酸化丝氨酸和苏氨酸),参与细胞的多种功能。
细胞中CDK激酶的活性受到多种因素的调控
CDK1的激活需要Thr14和Tyr15的去磷酸化Tyr161的磷酸化 Weel1可以促进Thr14和Tyr15的磷酸化 Cdc25可以促进Thr14和Tyr15的去磷酸化
CDK1的调节与活化; CAK=CDK1-Activiting Kinase
M-Cdk激酶的活性