2002级生物技术专业 实验一 储备液的制备 实验二 破碎细胞 实验三 分离、纯化DNA 实验四 琼脂糖凝胶电泳检测DNA 2005-3-21 哺乳动物基因组DNA的提取 实验一 储备液的制备 实验二 破碎细胞 实验三 分离、纯化DNA 实验四 琼脂糖凝胶电泳检测DNA 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》 2004-2005（下）分子生物学实验

一、实验目的 通过本实验了解并掌握提取动物基因组DNA的原理和步骤。 通过本实验熟练掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的实验技术。 熟练掌握分子生物学实验中各种仪器的使用方法及试剂的配制方法。 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

二、实验原理 天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA时，先把DNP抽提出来，再把P除去，再除去细胞中的糖，RNA及无机离子等。在EDTA和SDS等去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提，可以得到哺乳动物基因组DNA。 用此方法得到的DNA大小为100-150 kb，适用于λ噬菌体构建基因组文库和Southern分析。 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

三、仪器、材料和试剂 （一）仪器 高速冷冻离心机、微量取样器、玻璃匀浆器、 琼脂糖凝胶电泳系统：电泳仪、水平电泳槽、 紫外透射仪（或凝胶成像分析系统）、 恒温水浴器、高压灭菌锅、超净工作台、 超低温冰箱、电子天平、酸度计 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

（二）实验材料、用具、药品 2.1.5 mL微量离心管、微孔过滤器、 20mL注射器、各种型号的吸头 1.鼠肝或兔肝 2.1.5 mL微量离心管、微孔过滤器、 20mL注射器、各种型号的吸头 3.三羟甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基硫酸钠(SDS)、乙二胺四乙酸(EDTA)、醋酸钠（NaAc）、平衡酚、氯仿、异戊醇、乙醇、琼脂糖、蛋白酶K、RNA酶、DNA相对分子质量标准物、硼酸、溴酚蓝、蔗糖 溴化乙锭（危险） 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

（三）试剂 1. 5 mol／L NaCl 2. 0.5 mol／L Tris.HCl pH8.0 3. 0.5 mol／L EDTA pH8.0 4. 3 mol／L NaAc pH5.2 5. dddH2O 6. 生理盐水（0.85％ NaCl） 以上均高压灭菌 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

7. 10mg／mL蛋白酶K配好后用一次性过滤器过滤，-20℃保存； 8. 10mg／mL无DNA酶的RNA酶配好后用一次性过滤器过滤， -20℃保存； 9. 组织匀浆液 10.酶解液 11.提取液1：平衡酚(pH8.0)：氯仿：异戊醇＝25：24：1 12.提取液2：氯仿：异戊醇＝24：1 13.5×TBE 14.TE缓冲液 15.6×凝胶加样缓冲液 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

四、实验步骤 本实验在无液氮的条件下，制备鼠肝或兔肝DNA，与有液氮条件下相比，产量和质量都有所下降。 整个操作过程中，应尽量避免DNA酶的污染，特别注意动作温和，减少对DNA的机械损伤。 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

（一）储备液的制备（第一次） 7. 10mg／mL 蛋白酶K -20℃保存 8. 10mg／mL 无DNA酶的RNA酶 -20℃保存 1. 5 mol／L NaCl 2. 0.5 mol／L Tris.HCl pH8.0 3. 0.5 mol／L EDTA pH8.0 4. 3 mol／L NaAc pH5.2 5. dddH2O 6. 生理盐水（0.85％ NaCl） 以上均高压灭菌 7. 10mg／mL 蛋白酶K -20℃保存 8. 10mg／mL 无DNA酶的RNA酶 -20℃保存 9. 5×TBE 10. 6×凝胶加样缓冲液 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

（二）破碎细胞（第二次） 配制工作液 处死小鼠 取出肝脏 组织匀浆液 离心 无菌水 酶解液 水浴处理（55℃、12—18h） 酶解液 2002级生物技术专业 2005-3-21 （二）破碎细胞（第二次） 冰浴处理生理盐水 玻璃匀浆器 冰冷的生理盐水清洗 配制工作液 处死小鼠 取出肝脏 组织匀浆液 酶解液 2ml匀浆液 组织细胞液 玻璃匀浆器匀浆 移至1.5ml离心管 5000r／min30—60s 加400ul 吹散 加400ul 离心 无菌水 酶解液 水浴处理（55℃、12—18h） 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》 2004-2005（下）分子生物学实验

（三）分离、纯化DNA （第三次） 等量分装在两支离心管内 酶解样品 待抽提的样品 抽提 静置 离心 移出水相 至离心管 抽提 静置 2002级生物技术专业 2005-3-21 （三）分离、纯化DNA （第三次） 等量分装在两支离心管内 加入20ul的RNase 加入等体积①提取液500ul 4℃ 10min 酶解样品 待抽提的样品 抽提 静置 离心 配制 TE缓冲液 加等体积②提取液500ul 10000r／min离心10min 4℃ 10min 移出水相 至离心管 抽提 静置 10000r／min离心10min 加1/10 加2倍 放入 离心 移出水相 NaAc 无水乙醇 -75℃ 1-2h 12000r／min离心15min 加入 超低温冰箱 融化、离心 弃上清液 洗涤 12000r／min离心15min 干燥 4℃ 75%冷乙醇 离心 弃上清液 加TE 存放 DNA 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》 2004-2005（下）分子生物学实验

（四）琼脂糖凝胶电泳检测DNA （第四次） 制备琼脂糖凝胶 胶板的制备 加样 电泳 紫外投射仪检测 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中由负极向正极移动。 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

1.计算方法: （1）摩尔质量的计算: 质量(g) 分子量 5 mol／L NaCl 分子量58.44 x 58.44 （2）组织匀浆液：10ml 5 mol／L NaCl 100mmol／L 5 mol／L×x＝ 0.1mol／L ×10ml 0.2ml ÷体积(L) ＝摩尔体积（mol/L） ÷0.5(L) ＝5（mol/L） x＝ 146.1（g） 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

2.溶液的配置 （1) 3mol/L乙酸钠（sodium acetate）： 溶解20.4g的三水乙酸钠于约40ml水中，用冰乙酸调溶液的pH至5.2，再加水定容到50ml 。 (2) 0.5mol/L乙二胺四乙酸（EDTA）: 配制等摩尔的Na2EDTA和NaOH溶液（0.5mol/L），混合后形成EDTA的三钠盐。或称取9.31g的Na2EDTA·2H2O和1g的NaOH，并溶于约40ml水中，定容至50ml 。 (3) 5mol/L氯化钠（NaCl）： 溶解14.6g氯化钠于足量的水中，定容至50ml。 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

称取10gSDS慢慢转移到约含90ml的水的烧杯中，用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解。用水定容至100ml 。 (5) 10N氢氧化钠（NaOH）： 溶解40g氢氧化钠颗粒于约90ml水的烧杯中（磁力搅拌器搅拌），氢氧化钠完全溶解后用水定容至100ml 。 (6) 1mol/L盐酸（HCl）： 加8.6ml的浓盐酸至91.4ml的水中。 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

(7) 20mg/ml蛋白酶K（proteinase K）： 将200mg的蛋白酶L加入到9.5ml水中，轻轻摇动，直至蛋白酶K完全溶解。不要涡旋混合。加水定容到10ml，然后分装成小份贮存于-20℃。 (8) 10mg/mlRnase（无DNase）（DNase－free RNase）： 溶解10mg的胰蛋白RNA酶于1ml的10mmol/L的乙酸钠水溶液中（pH 5.0）。溶解后于水浴中煮沸15min，使DNA酶失活。用1mol/L的Tris－HCl调pH至7.5，于-20℃贮存。（配制过程中要戴手套） 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

(9)Tris缓冲液（Tris-HCl buffer） 将121g的Tris碱溶解于约0.9L水中，再根据所要求的pH（25℃下）加一定量的浓盐酸（11.6N），用水调整终体积至1L。 浓盐酸的体积（ml） pH 14 8.6 21 28.5 38 46 56 66 71.3 76 9.0 8.8 8.6 8.4 8.2 8.0 7.8 7.6 7.4 7.2 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

5×TBE（电泳缓冲液） 100mL 5.4gTris， 2.75g硼酸， 2mL 0.5mol／L EDTA(pH8.0) 加蒸馏水到100mL（1000ml） pH8.0 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

6×上样缓冲液 0．25％溴酚蓝：取60ml双蒸水，将250mg溴酚蓝溶解于其中 40％(W／V)蔗糖水溶液：在上述溶液中加入40g蔗糖 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

破碎细胞 1．取0.2g鼠肝或兔肝，用冰冷的生理盐水洗3次，然后置于2.0mL匀浆液中，用玻璃匀浆器匀浆至无明显组织块存在(冰浴操作，切匆将细胞破碎，可镜检观察)。 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

2．将组织细胞液移至1.5mL离心管中，5000r／min离心30—60s，(尽可能在低温下操作)，弃上清，若沉淀中血细胞较多，可再加入5倍于细胞体积的匀浆液洗一次。 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

3．沉淀加400uL无菌水迅速吹散，再加400uL酶解液，翻转混匀(动作一定要轻)55℃水浴处理12—18h。 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

分离、纯化DNA 4．取20uL RNase加入1.5ml离心管内，使RNase至终浓度200μg／mL，37℃水浴1h。 5．将待抽提的样品等量分装在两支离心管内，各加入等体积①提取液 酚／氯仿／异戊醇500ul，抽提 (慢慢旋转混匀，倾斜使两相接触面增大)一次。 4℃ 10min静置， 然后10000r／min离心10min。 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

6.有时如果DNA含量过高，水相在下层，实验时注意观察。用扩口吸头移出含DNA的水相(注意勿吸出界面中蛋白沉淀)。 7.然后加等体积②提取液氯仿／异戊醇500ul，抽提 ，4℃ 10min静置， 然后10000r／min离心10min (若界面或水相中蛋白含量多，可重复5，6，7操作) 。 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

9.再向每管中加入2.5倍体积的无水乙醇，-75℃ 1-2h。 8.用扩口吸头小心吸出上层含DNA的水相，加1／10体积的NaAc，小心混匀(要充分)。 9.再向每管中加入2.5倍体积的无水乙醇，-75℃ 1-2h。 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

11.75％冷乙醇洗涤一次，12000r／min离心15min。 12.室温干燥(不要太干，否则DNA不易溶解)，加入50μL TE缓冲液。 13.存放于4℃，轻摇溶解过夜(或2h)，即可得到实验动物基因组DNA。 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

琼脂糖凝胶电泳检测DNA （1）哺乳动物基因组DNA提取检测的电泳胶制备 A.支持胶：1％琼脂糖 称取0.4g琼脂糖，放人锥形瓶中，加入40mL，0.5×TBE缓冲液，置水浴加热至完全溶化，取出摇匀，则为1％琼脂糖凝胶液。 B.电泳胶：0.3％琼脂糖 称取0.18g琼脂糖，放人锥形瓶中，加入60mL的0.5×TBE缓冲液，置水浴加热至完全溶化，取出摇匀，则为0.3％琼脂糖凝胶液。 （由于蒸发作用，溶解前在容量瓶上作一个记号，溶解后用双蒸水补足） 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

（2）胶板的制备 ①取有机玻璃内槽，洗净，晾干， ②将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并在槽内底部放上玻璃，然后再放好样品梳子。 ③先用2.5％琼脂糖凝胶液将有机玻璃内槽的两端边缘封好(一定封严，不能留缝隙)。 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

④将熔化的琼脂糖凝胶液转入EB专用的三角瓶中，然后加入10mg/ml的EB4ul至终浓度0.5ug/ml。 ⑤将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒人有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(注意不要形成气泡)。 ⑥待胶凝固后（60min），取出梳子，取下有机玻璃片，放在电泳槽内。 ⑦加入电泳缓冲液(0.5×）至电泳槽中。 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

（3）加样 共20ul 1.样品DNA： 16ul 2.上样缓冲液： 4ul 1.Mark DNA样品： 6ul 2002级生物技术专业 2005-3-21 （3）加样 1.样品DNA： 16ul 2.上样缓冲液： 4ul 1.Mark DNA样品： 6ul 共20ul 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》 2004-2005（下）分子生物学实验

（4）电泳 ①接通电泳槽与电泳仪的电源(注意正负极，DNA片段从负极向正极移动)。保持电压190V。 ②当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳。 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

（5）实验结果 在紫外灯(312nm或254nm)下观察染色后的电泳凝胶(图实验12—1)。DNA存在处应显出桔红色荧光条带(在紫外灯下观察时应戴上防护眼镜，紫外线对眼睛有伤害作用)。 结果照片图 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

五、实验结果分析方法 1.紫外分光光度计 2.电泳（琼脂糖凝胶电泳） 3.二苯胺显色法测定 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

六、思考题 1.为什么在低温下进行？ 2.加入EDTA的作用？ 3.加SDS的作用？ 4.加饱和酚、氯仿有什么作用？ 5.加入异戊醇有什么作用？ 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

七、实验报告 哺乳动物基因组DNA的提取 （综合性实验报告） 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

细胞（Cell） 植物细胞 (plant cell) 动物细胞 (animal cell) 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

溶酶体(lysosome) 分为初级溶酶体和次级溶酶体。 溶酶体时酸性细胞器, 含有一系列消化降解酶(degradative enzymes); 分为初级溶酶体和次级溶酶体。 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

组织匀浆液 （装入10ml离心管中） 10ml 100mmol／L NaCl： 0.2ml（ 5M NaCl） 25 mmol／L EDTA(pH8．0)： 0.5ml（ 0.5M EDTA pH8．0) l0mmol／LTris.HCIpH 8．0)： 0.2ml（0.5M LTris.HCIpH 8．0) 加三蒸水: 9.1ml 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

酶解液（装入1.5ml离心管中） 1ml 200mmol／L NaCl：0.04ml （ 5M NaCl） 50mmol／L EDTA(pH 8．0)：0.1ml （ 0.5M EDTA pH8．0) 20mmol／LTris.HCl(pH 8．0)：0.04ml（0.5M LTris.HCIpH 8．0) 1％SDS： 0.1ml （10％ SDS） 200μg／mL蛋白酶K： 0.02ml （10mg／mL） 加三蒸水: 0.7ml 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

无DNA酶的RNA酶（-20℃保存） 10mmol／LTris.HCl 于100℃水浴处理15min以降解DNA 酶 缓慢冷却到室温。 将胰RNA酶溶于 浓度10mg／mL 15mmol／L NaCl 于100℃水浴处理15min以降解DNA 酶 缓慢冷却到室温。 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

平衡酚(pH8.0)：氯仿：异戊醇： 25：24：1 (体积比) 即配即用 每管加500ul 平衡酚(pH8.0)： 250ul 氯仿： 240ul 异戊醇： 10ul 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

氯仿：异戊醇：24：1(体积比) 即配即用 氯仿： 480ul 异戊醇： 20ul 每支试管加500 ul 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

TE缓冲液 5ml 10mmol／L Tris.HCl(pH 8．0)： 0.1ml（0.5M LTris.HCIpH 8．0) 1mmol／L EDTA(PH8．0)： 0.01ml（ 0.5M EDTA pH8．0) 加三蒸水至4.89mL 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

酚抽提除去蛋白质的示意图 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

二苯胺显色 加入二苯胺试剂2ml 乳白色 无色 沸水水浴10分钟。 无色 浅蓝色 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

二苯胺试剂的配制 A液:1.5 g二苯胺溶于100 mL 冰醋酸中再加15 mL浓硫酸,用棕色瓶保存。如冰醋酸呈结晶状态,则需加温后待其熔化,再使用。 B液:乙醛的体积分数为0.2%的溶液。 配制:将0.1 mL B液加入到10 mL A液中,现配现用。 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

细胞的破碎 由于高等动物DNA 主要存在于细胞核与线粒体中，所以提取时有两个困难（高等植物与此类似）： ①破碎细胞难；从处死动物٠分离组织器宫到破碎细胞费时长。在此时期间DNA 可能会被DNAase降解，而动物组织：特别是肌肉组织很难破碎,即使是较易破碎的肝٠肾等组织也往往使用组织匀浆器，易造成DNA 断裂。 ②分子量大，一般比细菌的大2—3个数量级，比病毒的大4—5个数量。对不同生物材料，要根据具体情况选择适当的分离提取方法。 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

核酸的酚抽提 原理：交替使用酚、氯仿两种蛋白质变性剂，更有效去除蛋白质。 氯仿还可加速有机相与水相的分层。 异戊醇：抑制界面泡沫的形成。 标准程序：酚——酚-氯仿——氯仿。 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

核酸的沉淀 原理：核酸与钠、钾、镁形成的盐在许多有机溶剂中不溶，也不会变性。 醋酸钠为沉淀DNA、RNA的最常用盐类。 有机溶剂：乙醇、异丙醇、聚乙二醇。 温度：冰水 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

核酸的理化性质 物理性质 1.性状： RNA及其组分核苷酸、核苷、嘌呤碱、嘧啶碱的纯品都呈白色的粉末或结晶；DNA则为疏松的石棉一样的纤维状固体。 2、溶解性： RNA和DNA都是极性的化合物，一般说来，这些化合物都微溶于水，不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂。它们的钠盐易溶于水。 DNA和RNA在生物细胞内都与蛋白质结合成核蛋白。DNA核蛋白与RNA核蛋白的溶解度受溶液的盐浓度的影响而不同。DNA蛋白在低浓度的盐溶液中随盐浓度的增加而增加，在1mol/L的NaC溶液中溶解度比纯水高2倍，在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最低，仅为水的1%，几乎不溶解；而RNA蛋白在盐溶液中其溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14mol/L的NaCl溶解度较大。因此，在核酸的提取中，常用此法将两种核蛋白分开，然后用蛋白质变性剂去除蛋白质。 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

核酸分子中含有嘌呤碱和嘧啶碱，因而具有紫外吸收的的性质。在260nm处核酸紫外吸收最强。核酸的紫外吸收是核酸定量测定的基础。 核酸的两性电离与等电点 核酸的磷酸基具有酸性，碱基具有碱性，因此，核酸具有两性电离的性质。但核酸中磷酸基的酸性大于碱基的碱性，其等电点偏酸性。DNA的pI约为4-5，RNA的pI约为2.0-2.5，在pH7-8电泳时泳向正极。  UV吸收 核酸分子中含有嘌呤碱和嘧啶碱，因而具有紫外吸收的的性质。在260nm处核酸紫外吸收最强。核酸的紫外吸收是核酸定量测定的基础。 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

DNA的提取方法简介 为了研究DNA分子在生命代谢中的作用，常常需要从不同的生物材料中提取DNA.由于DNA分子在生物体内的分布及含量不同，要选择适当的材料提取DNA。 动植物中，小牛胸腺۰动物肝脏۰鱼类精子，植物种子的胚中都含有丰富的DNA。 微生物中，谷氨酸菌体含7%~10%，面包酵母含4%，啤酒酵母含6%，大肠肝菌含9%~10%。 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

从各种材料中提取DNA方法不同，分离提取的难易程度也不同。 对于低等生物。如从病毒中提取DNA 比较容易，多数病毒DNA 分子量较小，提取时易保持其结构完整性。 从细菌及高等动植物中提取DNA难度大一些。细菌DNA 分子量较大，一般达2×10 道尔顿。因此易被机械张力剪断。细菌DNA，除核DNA 外，还有质粒DNA 等。 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

一、 分离核酸的一般原则 因为遗传信息全部贮存在核酸的一级结构中，故完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的基础。 核酸的分离纯化、测定及研究方法 一、 分离核酸的一般原则 因为遗传信息全部贮存在核酸的一级结构中，故完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的基础。 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

（一）核酸的分离和纯化时应遵循两个原则： ① 保证核酸一级结构的完整性； ② 排除其它分子的污染。 （二）核酸的纯度要求 ① 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； ② 其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度； ③ 排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时，应去除RNA，反之亦然。 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

（三）核酸分离纯化的注意事项 为保证分离核酸的完整性和纯度，在实验中应注意： ① 尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏； ② 减少化学物质对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH4～10条件下进行； ③ 防止核酸的生物降解。细胞内或外来的各种核酸酶水解核酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构。其中DNA酶需要金属二价阳离子Mg2+，Ca2+的激活，因此使用金属离子螯合剂，如EDTA或柠檬酸盐等基本上可以抑制DNA酶的活性。而RNA酶不但分布广泛、极易污染样品，而且耐高温、耐酸碱、不易失活，所以生物降解是RNA提取过程中的主要危害因素； ④ 减少物理因素对核酸的降解，物理降解因素主要是机械剪切力，其次是高温。 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

高温：如长时间煮沸，除水沸腾带来的剪切力外，高温本身对核酸分子中的某些化合键也有破坏作用。核酸提取过程中常规操作温度为0～4℃以降低核酸酶的活性从而减少对核酸的生物降解。 机械剪切力：包括强力高速的溶液振荡、搅拌，细胞突然置于低渗液中；细胞爆炸式地破裂及DNA样品的反复冻融等。这些操作细节在实验操作中应加倍注意。机械剪切作用的主要危害对象是大分子量的线性DNA分子，如真核细胞的染色体DNA等。 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》

二、核酸分离纯化的一般步骤 破碎细胞→去除蛋白质、多糖、脂类等生物大分子→沉淀核酸→去除盐类、有机溶剂等杂质→纯化干燥→溶解。 核酸提取方案，应根据具体生物材料和待提取核酸分子的特点而定。对于某特定细胞器中富集的核酸分子，采用先提取细胞器后再提取目的核酸分子的方案，可获得完整性和纯度两方面质量均高的核酸分子。 2018/12/6 2003级 《分子生物学实验》