不同迴流流速操作條件下厭氧氨氧化反 應效能與菌相變化之研究

摘要 厭氧氨氧化反應(Anammox, Anaerobic Ammonia Oxidation)為將氨氮(NH4+)及亞硝酸氮(NO2-)直接反應生成氮氣(N2)。此反應具有不需添加碳源與曝氣、污泥產量低等諸多優點。由於操作條件如反應槽上升流速等對於系統效能有直接之影響，因此本研究設計厭氧氨氧化批次反應槽，控制不同的污泥迴流流速，分別為0 ml/min、10 ml/min、100 ml/min，利用可區分菌種活性之藥品Propidiummonoazide (PMA)和聚合酶鏈鎖反應-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)等分子生物技術以及水質分析方法，探討不同污泥迴流流速條件下其系統具活性之厭氧氨氧化菌群結構變化和除氮效能間的關係。

一、 前言 由於都市快速發展，使得部分工業廢水、家庭廢水未經適當處理即排入天然水域中，導致環境中氨氮濃度逐漸增加，可能會降低水中溶氧及影響水質的安全衛生，進一步對原有的自然環境生態造成破壞，故近年來國內環保單位正討論並草擬更嚴格的放流水標準以保護生態平衡。目前有許多研究以發展出多種去除含氮污染物的處理程序，其中的生物處理法仍是處理含氨氮廢污水最經濟的方法之一。 近年研究發現，特殊的自營性微生物可於無氧環境下，利用二氧化碳(CO2)作為碳源，將氨氮(NH4+)與亞硝酸根離子(NO2-)反應直接轉化生成氮氣(N2)(Jettenet al., 2001) ，此除氮機制即所謂的厭氧氨氧化反應(Anaerobic AmmoniaOxidation, Anammox)，其化學方程式為NH4+ + NO2- →N2 + 2H2O。此程序有別於一般傳統硝化結合脫硝程序系統，具有不需添加碳源、污泥產量低以及不需額外曝氣節省能源消耗等諸多優點；此外，其應用範圍廣泛，包含工業製程廢水、畜牧業廢水以及掩埋場滲出水等。

近年來諸位學者利用Ethidium monoazide (EMA)或Propidium monoazide(PMA)區分環境樣本的菌群存活與否，過去的研究中有學者針對EMA 與PMA進行比較與探討，由結果發現EMA 對於活菌具有毒性但PMA 則否(Pan et al.,2007)；此外，PMA 對於生物膜的通透性較佳，因此對於菌種的專一性較強(Nocker et al., 2006；Flekna et al., 2007；Cawthorn and Witthuhn, 2008)。過去有學者利用Propidium monoazide (PMA)藥品區分環境樣本中菌種之死活，並透過分子生物技術PCR-DGGE，探討微生物組成（Nocker et al., 2006）。但目前相關文獻鮮少探 討具活性的厭氧氨氧化菌種之定性分析，因此無法釐清真正存活於系統中的厭氧氨氧化菌群，若能建立區分厭氧氨氧化菌種存活與否的分析方法，將有助於厭氧 氨氧化系統穩定與功能提升。

二、 實驗材料與方法 1. 樣本來源 2. Propidium Monoazide (PMA)處理 本研究取自於工業技術研究院所架設不同污泥迴流流速之厭氧氨氧化系統中污泥樣本。取適量之污泥以10000rpm 離心1 分鐘以收集污泥沉澱物(pellet)並去除上澄液，利用1×PBS 再懸浮並以10000rpm 離心1 分鐘，重複上述步驟以清洗pellet。 2. Propidium Monoazide (PMA)處理 將PMA 溶於20 % dimethyl sulfoxide，濃度配置為20 mM，將2.5 μL PMA加入500 μL 的樣本並放置於暗處5 min，之後將樣本置於冰上並開啟650W 的鹵素燈照射樣本2~4 min，再以10000rpm 離心2 分鐘(Nocker et al., 2009)。

3. DNA 萃取及聚合酶鏈鎖反應 將樣本利用商用試劑UltraCleanTM Soil DNA Isolation Kit (Mo Bio, USA)進行DNA 萃取。將萃取後之DNA 進行PCR 增幅，本研究將使用之引子為針對厭氧氨氧化菌之PLA46f 及Amx368r 與針對氨氧化菌之amoA gene 引子對(1F vs2R)，其相關實驗條件如文獻所示(Neef et al., 1998；Schmid et al., 2003)以及(Rotthauwe et al., 1997)。將PCR 增幅後之產物，利用1.5%之瓊脂膠糖明膠進行電泳(Agarose gel)分析，再以Safe ViewerTM Nucleic Acid Stain 染色30 分鐘並以紫外光顯像。 4. 變性梯度凝膠電泳分析及DNA 純化 本研究使用之DGGE 膠體為6 % (wt/vol) acrylamide/bis，變性梯度範圍為30% ~ 55 %分析以PCR 所增幅針對Anammox 族群之產物。利用變性梯度凝膠電泳槽(Dcode gene System, Bio-Rad)，以80 伏特電壓及60 ℃條件下進行電泳12 小時，最後利用Safe ViewerTM Nucleic Acid Stain 進行核酸染色，並以紫外光顯像。PCR-DGGE 分析後，將膠體上相異的亮帶分別切下後置於無菌水中，經過冷凍-解凍過程獲取目標DNA 片段；並重複進行PCR-DGGE 與切膠純化的分析直至確定為單一亮帶為止。

5. 水質分析 系統水質監測部份，由工研院每週監測進出流水之NH4+-N、NO2--N、與NO3--N ， 其分析方式為利用離子層析儀（ Ion Chromatography, IC ， 型號DioNEX-DX100，陰離子分析管柱AS-4A，流洗液為NaCO3 與NaHCO3；陽離子分析管柱CS-15、流洗液為H2SO4）。

三、 結果與討論 1. Propidium monoazide (PMA)與厭氧氨氧化族群之分析方法本研究先以系統污泥經過處理(放置於100 ℃水浴中30 min 並加入70 %酒精反應30 min)與未處理後分別添加PMA 進行測試，並以針對厭氧氨氧化菌之專一性引子對PLA46 和AMX368 分析系統中污泥樣本(如表1)，利用agarose gel確定產物長度為377 bp(如圖1 所示)。由分析結果發現經馴化後的樣本有明顯亮帶，代表系統中確實存在厭氧氨氧化菌，並正確的增幅其目標片段。此外，由結果亦發現經過高溫與酒精處理後之馴養污泥添加PMA 後，其增幅之亮帶並未十分明顯，亦證明PMA 可與死亡菌種之DNA 結合，因此無法藉由PCR 增幅放大，故DGGE 圖譜中(圖2)亮帶並不明顯，由此結果得知，PMA 方法確實可以用來進行厭氧氨氧化菌群之存活與否作判別。

2. 批次厭氧氨氧化系統菌相變化與除氮效能之分析本實驗原始污泥來自於生物除氮系統馴養後之污泥，植種於低溶氧濃度的UASB 反應槽，所使用之基質採氨氮與亞硝酸鹽以約一比一之濃度進流，不添加額外碳源，以三種不同的污泥迴流流速馴養厭氧氨氧化菌，嘗試探討最佳的污泥迴流流速，作為提供日後實廠操作所需之重要參數。分別採集操作初期(反應槽操作56 天)、操作穩定(反應槽操作115 天)等不同時期污泥樣本，以DGGE 進行微生物族群分析，並探討菌相消長與系統中除氮效能間關係。 (1) 污泥迴流流速為0ml/min 當污泥迴流流速為0ml/min 時，系統中的氨氮與亞硝酸氮去除率不盡理想。由批次水質實驗得知，進流氨氮濃度約為70 mg/L，經12 小時反應後，出流濃度僅去除至50 mg/L，去除率約為30 %；亞硝酸氮部分，進流濃度約為180 mg/L，出流濃度僅減低至150 mg/L，去除效率約為20 %；硝酸氮部分僅增加0.1 mg/L；而氮氣部分約增加44 ml(如圖3)，此系統中氨氮及亞硝酸鹽去除率不佳，未有硝酸鹽的累積，但有大量的氮氣產生。

污泥迴流流速為0ml/min 時之族群分析如圖4 所示，由結果中得知此時系統中存在厭氧氨氧化菌Candidatus Brocadia anammoxidans、Candidatus Brocadiasp.、Candidatus Kuenenia stuttgartiensis；此外，亦發現有氨氧化菌存在於系統中。系統中氨氮與亞硝酸鹽去除不佳，推測可能因為厭氧氨氧化菌無法與基質充分混合均勻，導致部份菌群死亡，釋放至反應槽中COD 之濃度高達97 mg/L，因此可能存在異營脫硝菌與厭氧氨氧化菌競爭，消耗系統中的亞硝酸鹽與硝酸鹽，並增加氮氣的產量；此外，由於異營菌生長快速，可能會取代厭氧氨氧化菌成為系統中的優勢菌種，導致除氮效果不良。因此未來建立厭氧氨氧化反應槽時，應定期監測系統中之碳氮比，避免造成異營性微生物成為系統中的優勢菌種。

(2) 污泥迴流流速為10ml/min 當污泥迴流流速為10 ml/min 時，系統中的氨氮與亞硝酸氮去除率十分良好。由批次水質實驗得知，進流氨氮濃度約為60mg/L，出流濃度去除至0 mg/L，去除率約為100 %；亞硝酸氮部分，進流濃度約為120 mg/L，出流濃度僅減低至3 mg/L，去除效率約為97 %，而硝酸氮部分，增加約為30 mg/L；而氮氣部分約增加38 ml(如圖5)。此系統即可在12 小時內幾乎將氨氮與亞硝酸氮完全去除，除氮能力十分良好，且有少量硝酸氮之累積與氮氣之產生，十分符合典型的厭氧氨氧化反應。 污泥迴流流速為10ml/min 時之族群分析如圖6 所示，由結果中得知此時系統中存在厭氧氨氧化菌Candidatus Brocadia anammoxidans、Candidatus Brocadiasp.、Candidatus Kuenenia stuttgartiensis；此外，亦發現有氨氧化菌存在於系統中。此系統的除氮效率極佳，推測系統中的厭氧氨氧化菌能充分與基質混合，並且保持污泥結構緊密，使氨氮與亞硝酸鹽的去除效率最好，因此未來實場若操作厭氧氨氧化系統時，建議可採用較低的污泥迴流流速(如流速為10 ml/min)，做為反應槽設計參數之一。

(3) 污泥迴流流速為100ml/min 當污泥迴流流速為100 ml/min 時，系統中的氨氮與亞硝酸氮去除率較差。由批次水質實驗得知，進流氨氮濃度約為50 mg/L，經12 小時反應後，出流濃度去除至13 mg/L，去除率約為74 %；亞硝酸氮部分，進流濃度約為130 mg/L，出流濃度減低至45 mg/L，去除效率約為 65 %，而硝酸鹽氮部分，增加約為30mg/L；而氮氣部分約增加1 ml(如圖7)。氨氮與亞硝酸氮去除率較低，累積較多的硝酸鹽，但僅產生微量的氮氣；此外，亦發現此系統中的ORP 均高於200 mV且溶氧均高於2 mg/L。而當系統操作120 天後水中pH 逐漸降低於7 以下且累積於系統的硝酸鹽濃度大幅上升，因此在150 天更換基質時於系統內沖提氮氣，使ORP 小於50 mV 讓環境為無氧狀態，由水質數據發現，系統中的氨氮與亞硝酸鹽幾乎沒有去除，且系統操作169 天後，由針對氨氧化菌的agarose gel 圖譜中(如圖8)發現，此時系統中的氨氧化菌喪失其活性。

污泥迴流流速為100ml/min 時之族群分析如圖9 所示，由結果中得知此時系統中存在有厭氧氨氧化菌Candidatus Brocadia anammoxidans 、CandidatusBrocadia sp.、Candidatus Kuenenia stuttgartiensis；此外，亦發現有氨氧化菌存在於系統中。過去文獻指出在高剪力的環境下，會導致厭氧氨氧化顆粒污泥破碎，而造成厭氧氨氧化菌活性降低(Arrojo et al., 2008)，因此推測操作於高流速的環境，可能會降低厭氧氨氧化菌的活性；此外，系統中溶氧與ORP 過高將導致硝化菌大量生長，可能取代厭氧氨氧化菌成為系統中的優勢菌種。因此未來操作厭氧氨氧化系統，應避免流速過快而造成厭氧氨氧化菌活性降低之現象。

表.

圖.

四、 結論 1. 污泥迴流流速為0 ml/min 時，推測厭氧氨氧化菌可能無法與基質充分混合， 而導致部份菌群死亡， 增加系統中COD 之濃度， 可能造成異營菌與厭氧氨氧化菌競爭， 影響整體的除氮效率。 2. 污泥迴流流速為10 ml/min 時， 推測厭氧氨氧化菌與基質均勻混合，並保持污泥結構緊密， 使總氮去除率十分良好。 3. 污泥迴流流速為100 ml/min 時， 推測操作於高流速的環境，可能會降低厭氧氨氧化菌的活性；此外，系統中溶氧與ORP 過高將導致硝化菌大量生長，可能取代厭氧氨氧化菌成為系統中的優勢菌種。 4. 未來操作厭氧氨氧化系統，應避免流速過快而造成厭氧氨氧化菌活性降低， 建議可採用低迴流流速10 ml/min 作為反應槽設計參數之一； 此外， 應定期監測系統中碳氮比， 避免異營性微生物成為系統中優勢菌種。