胚乳和胚柄的形成和作用 一、胚乳的起源 开花植物中，胚囊的种类有四孢子起源、二孢子起源、单孢子起源，即使是单孢子起源，核在胚囊内迁移的数目和位置决定了中心细胞的核数目，从而决定受精后胚乳的倍性。因此，胚囊的结构提供了双受精的基础。 多数开花植物通过典型的双受精过程形成三倍体胚囊。

玉米和拟南芥胚囊的发育和结构。

二、胚乳的发育过程 禾本科植物和拟南芥胚乳发育经过两个主要阶段：多核体胚乳阶段和胚乳细胞化阶段。 多核体胚乳阶段中三倍体胚乳核经过多次分裂，核之间不形成成膜体，游离的核先在中心细胞珠孔端均匀分布，然后在中心液泡外层细胞质中均匀分布，直到整个细胞质中平均分布，成为完全的胚乳多核体。 胚乳细胞化阶段起始阶段是在多核体中围绕每个核形成径向辐射状微管系统RMS（Radial microtubule system），之后形成核膜。接着细胞化和细胞多次分裂的过程。

禾本科植物 禾本科植物和拟南芥的多核体胚乳发育

禾本科植物中首先多核体中围绕每个核形成径向辐射状微管系统RMS，RMS组织形成核膜，接着垂周细胞壁(Anticlinal cell walls， acw)把每个核分开，与中心液泡（central vacuole,cv）之间成小泡或管状(alveoli，alv)。小泡核分裂后进行平周细胞分裂，形成平周壁(periclinal cell wall， pcw)。内层小泡层继续重复平周分裂，直到胚乳完全细胞化 。 胚乳发育过程 球型胚期间拟南芥胚乳多核体分布有不同的区域性。胚乳细胞化具有梯度阶段性。围绕胚区域（cellular MCE）首先细胞化，随着胚的发育，接着是胚乳节(nodules，no)、 合点区(chalazal cyst，cz)，早鱼雷期完成胚乳细胞化(ce)。在种子成熟过程中胚乳被消耗掉，成熟胚(mature embryo，me)时周围留下糊粉层细胞(aleurone-like cell，alc) 。

三、胚乳的结构和功能 以胚乳为主要贮藏组织的种子，胚乳细胞根据其位置和功能有不同结构。以玉米为例，玉米胚乳细胞分为淀粉样胚乳 (se)、糊粉层 (al)、转运细胞(tc)、 围绕胚的细胞（Embryo-Surrounding Region，ESR）几部分 。

围绕胚的细胞ESR 功能：胚的营养；种子发育中胚和胚乳的物理屏障；为胚和胚乳之间通讯提供通道。 玉米ESR1、ESR2、 ESR3、ZmAE1 (Zea mays androgenic embryo1)、ZmAE3在 授粉后5-20天在ESR区特异表达。ESR蛋白定位于ESR细胞壁。ESR3与CLV3的一个保守区域相同，是小的亲水蛋白。CLV3与受体类激酶CLV1和CLV2相互作用，调控分生组织大小，其功能区域与一类带有信号肽的小的亲水蛋白族CLE相似。无胚胚乳中缺乏Esr的表达，说明它的表达需要来自胚的信号 。

淀粉样胚乳 胚乳的主要功能是为胚提供营养，淀粉胚乳细胞贮藏淀粉和蛋白质，淀粉胚乳细胞有两类不同的来源。一是细胞化后胚乳中心的细胞分裂而来。开始是平周分裂，以后分裂的方向随机。第二个来源是糊粉层下的细胞平周分裂形成。用化学突变研究决定淀粉层分化的基因，玉米中找到了dsc1 (discolored1) ，emp2 (empty pericarp2)突变，但其功能尚不清楚 。

糊粉层(aleurone layer) 胚乳外层是糊粉层细胞，糊粉层的功能是接受胚中的信号后，通过合成水解酶、葡聚糖酶、蛋白酶将贮藏的淀粉和蛋白降解运出。 玉米和小麦有一层糊粉层细胞，水稻有几层，大麦有三层，大麦糊粉层细胞高度多倍体化。玉米糊粉层细胞经过17次垂周分裂形成约25万个细胞。 糊粉层的标记基因在大麦是LTP2, B22E、PZE40、 OLE-1、OLE-2、PER-1、CHI33，玉米是C1、XCL1 (EXTRA CELL LAYER1) 、DAL1、DAL2 (DISORGANIZED ALEURONE LAYER1, 2)，表明糊粉层细胞分裂的方向受遗传因素控制。

拟南芥影响糊粉层形成的三个基因CR4（CRINKLY4）、DEK1（DEFECTIVE KERNEL 1）、SAL1（SUPERNUMERARY ALEURONE LAYER1）编码类似细胞-细胞间信号传递蛋白。 CR4编码类似肿瘤坏死因子的受体激酶类分子，其相似区域在细胞外富含Cys区域，该区域是配体结合位点。 DEK1编码一个2159个氨基酸的蛋白，该蛋白有一个N端膜定位信号，接着是一段跨膜区域，跨膜区域中间被细胞外环中断；细胞内的C端编码calpain样Cys蛋白酶区域。结构上与动物calpain相似，体外有Cys蛋白酶活性。在玉米中普遍表达。 SAL1编码204氨基酸蛋白，类似于人类Charged vesicular body protein1/Chromatin modulating protein1，是保守的E类液泡蛋白分类和小泡膜交通相关的蛋白，在玉米中普遍表达。

体外玉米胚乳器官培养研究表明，胚乳细胞的与母体相邻的表面位置是决定糊粉层分化的充分因素。 培养的胚乳组织外层糊粉层细胞分裂后形成的内层子细胞逐渐失去传递细胞特性，dek1和sal1突变体胚乳组织在体外培养同样表现出没有糊粉层和多层糊粉层的表型。 DEK1和CR4在其他拟南芥其他器官表皮中也起着决定表皮特性的作用，说明表面位置是决定糊粉层形成的重要因素 。

DEK1和CR4共同定位于糊粉层质膜和内体，SAL1也与DEK1和CR4共同定位于内体(细胞内膜泡)。 糊粉层幼小细胞之间胞间连丝丰富， CR4偏向分布在胞间连丝部位，DEK1的膜内和膜上部位片段都不能独立恢复dek1的野生型表型，Tian等人根据这些结果提出了决定糊粉层特性的模式： DEK1感受或传递位置信号，CR4促进信号分子在糊粉层细胞之间的运动，SAL1通过内体的运动和降解维持DEK1和CR4在质膜上保持一定浓度 。

转运细胞（Transfer Cells） 转运细胞又称传递细胞，在母体组织上方胚乳基部发育。功能是运输蔗糖、氨基酸、单糖。玉米（miniature1)种子小粒，细胞壁转化酶2活性低，表明转化酶通过将蔗糖水解成葡萄糖和果糖在母体共质体和胚乳外质体之间建立蔗糖梯度。玉米胚乳由外向内有两到三层传递细胞，其细胞壁内叠程度相应地从外向内也形成递减梯度 。

一些基因在胚乳基部未来传递细胞形成的部位特异表达，可能与传递细胞专一性形成有关。已经鉴定的决定传递细胞特性的基因有大麦ENDOSPERM1 (END1)、玉米 MYB-相关蛋白-1 (ZmMRP-1)。大麦END1在胚乳多核细胞期基部未来传递细胞形成处特异表达 。 ZmMRP-1只有一个基因拷贝，定位于第8条染色体，受精后在多核体胚乳的细胞基部核质区积累表达，决定未来细胞化后形成传递细胞。ZmMRP-1在细胞发育过程中一直表达，成熟后不再表达。ZmMRP-1反式作用在BETL-1 、BETL-2启动子和maternally expressed gene1(MEG1)启动子上， 激活这些基因的表达。

Betl1(Basal endosperm transfer cell layer1)在胚乳基部细胞表达，与细胞壁紧密结合。MEG1是富含半胱氨酸的糖蛋白，胚乳发生早期在传递细胞中只有母方基因表达，父方基因被甲基化失活，晚期父母双方的基因都表达，说明母方印迹在早期的作用 。 BAP2胚乳基部细胞之间，主要积累在花梗厚壁的细胞间。此外，相关区域表达的蛋白还有玉米BETL2、BETL3、BETL4、BAP1 (BASAL LAYER-TYPE ANTIFUNGAL PROTEIN1)、BAP3。许多蛋白与抗微生物蛋白相似，说明具有防御功能 。

传递细胞的形成还受其他因素影响。莴苣中木质部传递细胞由高浓度CO2刺激诱导，Vicia faba（蚕豆）传递细胞由葡萄糖和果糖诱导，蔗糖没有效果。 多细胞核胚乳基部衍生的两三层传递细胞与其他部位单层糊粉层不同，决定两类细胞命运的机理可能不同。缺乏糊粉层的defective kernel1 (dek1)突变体传递细胞正常，传递细胞可能受到细胞系遗传的影响 。

周围组织 在胚和胚乳发育过程中，胚珠中珠被发育形成种皮，其他一些无关的珠心细胞经过细胞程序化死亡被消除。蓖麻种子发育过程中围绕胚乳和胚的外围珠心细胞和内珠被，含有很多蓖麻蛋白消化酶小体，其中的蓖麻蛋白消化酶在珠心细胞程序化死亡中起重要作用。授粉后20天，内珠被消失。具有内叠的细胞壁的传递细胞是供给营养的细胞特征，在胚和胚乳发育早期，胚乳最外层细胞具有传递细胞特征，营养供给由围绕整个胚乳的正在降解的外围组织提供，外围珠心细胞和内珠被消失后脉管系统仍然活跃，为胚乳和胚重量和体积的增大提供代谢物 。

种子大小的决定 二倍体母体的珠被、单倍体胚囊、三倍体胚乳以及胚之间在发育过程中发生相互作用，共同决定种子的大小。 一、母体珠被影响胚乳的发育和种子大小 拟南芥珠被细胞繁殖的起始、最终细胞数目与细胞延长平衡，不由种子大小决定。珠被细胞延长在胚乳大小与珠被之间的协同中起关键作用，这种协同影响以后的胚乳细胞化和胚细胞繁殖，最后决定种子大小。

TRANSPARENT TESTA GLABRA2(TTG2)编码WRKY家族的转录因子，在种皮中高表达，胚乳中低表达。 突变体花青素原合成缺乏，隐性纯合体种子长度减小15%，球型胚期种子大小开始减小，相应的胚乳大小也减小，同时种皮细胞延长减少，胚乳细胞化时间提早到胚乳8时期。野生型胚乳细胞化时间在阶段九。 WT ttg2/ttg2 ttg2/ttg2纯合体与野生型花粉杂交，子代种子大小比野生型小，反之野生型胚珠与ttg花粉杂交，种子是野生型大小。ttg2/+杂合体形成一半的雌配子野生型，一半突变型，用野生型和突变型花粉授粉都是正常大小的种子，说明种皮表达的基因影响种子生长 。 iku2 iku2 tg2

WT ttg2 iku2 iku2 tg2 胚乳细胞化时间在阶段九 胚乳细胞化提前到阶段八 胚乳细胞化提前到阶段八 胚乳细胞化提前到阶段七 编码含亮氨酸重复序列激酶的iku2（kaihu2）突变也造成胚乳减小，从而引起种子从球型胚出现减小，同样胚乳细胞化提前一个阶段到阶段八， iku2 tg2双突变胚乳细胞化提前两个阶段到七具有叠加效应。在iku2纯合背景下ttg2同样表现出母本决定的种子减小症状 。

内珠被特异表达的细胞色素p450蛋白KLU（cytochrome P450 KLUH）促进种子生长，是调控种子大小的必要因素 。 胚珠珠被细胞数目对种子大小影响有限 KRP2作用造成珠被细胞数目减少

珠被细胞延长是珠被限制种子大小的关键因素 iku突变限制胚乳生长，间接减少珠被细胞延长。对iku1/+;P35SKRP2/+植物用iku/iku花粉授粉，半数种子胚乳被KRP2作用造成的细胞数目减少的珠被围绕，珠被细胞数目减少33%， 但细胞延长了31%，种子大小与iku/iku相似。这说明珠被通过细胞延长调整适应胚乳通过IKU途径决定的种子大小 。

二、雌配子体和胚乳控制种皮的细胞繁殖和分化 珠被是种皮的前身，珠被的生长包括了细胞分裂和细胞延长。珠被在未受精和受精后都进行生长，但调控机理不同。 受精前珠被在胚珠成熟时起始有丝分裂，授粉两天后有丝分裂活性急剧下降。这种繁殖的停止与种皮在授粉后4天的细胞延长相对应。然而受精后的种皮比未受精种皮的细胞繁殖活性强的多，说明受精、胚乳、或胚提供了种皮生长的信号 。

未受精胚乳自发发育突变体msi1和rbr1未受精雌配子中有自发细胞分裂现象，种子与野生型相似。但rbr1种皮没有生长发育。msi1未受精雌配子中胚乳发育。rbr1未受精雌配子中中心细胞繁殖发育，具有异常配子体特性 。 sn, supernumerary nuclei

用标记有丝分裂的周期蛋白B（cycB）启动子控制的GUS转化未受精胚乳自发发育突变体msi1和rbr1，观察未受精珠被的细胞繁殖速率。msi1珠被细胞分裂活性增强，种皮细胞繁殖周期延长，胚乳在授粉后1.5天也开始繁殖。而合子的第一次有丝分裂在授粉后四天，说明msi1 的种皮和胚乳繁殖信号来自雌配子体。rbr1突变胚珠中，授粉后三天以前有丝分裂正常，受精后才触发有丝分裂活性，说明rbr1 与受精诱导的珠被细胞持续分裂有关。

胚乳标记基因KS117野生型雌配子体中无表达，受精后在16核阶段胚乳中表达，在msi1突变体的未受精发育中种子中表达，而在未受精rbr1 16核雌配子体中无表达。说明msi1未受精种子中胚乳发育, 而rbr1未受精种子中繁殖的是雌配子特性的细胞，不是种子发育的胚乳。 PAs are specifically deposited in the endothelium cells of the seed coat upon fertilization msi1未受精种子胚乳的发育促进了种皮细胞繁殖、延长和分化，另外只有卵受精的种子的种皮和去掉胚乳的种皮都没有明显的生长，说明胚乳促进种皮的细胞繁殖、延长和分化。

rbr1未受精雌配子体中，助细胞中MYB98表达量非常高，在合点端过量繁殖的组织中也存在 野生型雌配子体中，在除了反足细胞以外的雌配子体表达， 成熟雌配子体中只在两个助细胞中大量表达，在中心细胞微量表达， 受精后继续在助细胞中表达，并在胚乳中表达 说明rbr1突变体雌配子体合点端过量繁殖的组织主要来源于中心细胞，卵细胞装置没有明显分裂，说明rbr1突变不引起种子的自动发育。

PMEDEA:GUS staining in the female gametophyte GUS staining is detected in supernumerary nuclei (arrowheads) in the rbr1 female gametophyte PMEDEA:GUS in the central cell upon fusion of the polar nuclei

Ovule with the megaspore (arrowhead). Two-nucleate-stage ovule. Four-nucleate-stage ovule. Eight-nucleate-stage ovule Maturing female gametophyte Mature female gametophyte. Dynamic Analysis of the PRBR1:RBR1-mRFP1 Fusion Protein during Female Gametophyte Development 而去雄的rbr1突变体雌配子体没有完全成熟，种皮也没有发育。RBR1在珠被中表达，在雌配子体的三个有丝分裂过程中的所有核中一直有表达，FG5阶段表达减少，极核融合后主要在雌配子体的中心细胞表达。因此野生型这个时期细胞周期的停止直接依赖RBR1。

三、决定种子大小的调控因子 细胞分裂和分化是种子大小决定的必要因素，影响细胞分裂与分化的因素都会影响种子大小。生长素信号传导中的ARF2、细胞分裂素受体AHK2、3、4都影响种子大小 。BR activates expression of SHORT HYPOCOTYL UNDER BLUE1, MINISEED3, and HAIKU2, which are known positive regulators of seed size, but represses APETALA2 and AUXIN RESPONSE FACTOR2, which are negative regulators of seed size. These genes are bound in vivo by the BR-activated transcription factor BRASSINAZOLE-RESISTANT1 (BZR1) 影响胚乳细胞化的三个基因MINISEED3(MINI3)、IKU2，IKU1在同一个调控途径中决定拟南芥种子的大小。MINI3是一个WRKY家族的转录因子， 在花粉和授粉后12小时两核期的发育中胚乳表达，IKU2是富含亮氨酸的激酶，它们在调控途径中的作用顺序可能是IKU1、MINI3、IKU2, 其中MINI3自身有负反馈调节作用。这三个基因的突变使胚乳细胞化提早进行，造成小种子现象 。

与胚乳中染色质修饰相关的复合体蛋白FIS、MEA、FIS2、FIE、MSI1受精前防止胚乳发育，也影响种子的大小。 但embryo-specific overexpression of FIE, PHE1, and MINI3 has no influence on seed size and weight, nor on oil, protein, or sucrose content; overexpression of IKU2 results in seeds with increased size and weight, and oil content of overexpressed IKU2 seeds is increased by 35%.

Arabidopsis APETALA2 (AP2) controls seed mass maternally, with ap2 mutants producing larger seeds than wild type. AP2 influences development of the three major seed compartments: embryo, endosperm, and seed coat. AP2 appears to have a significant effect on endosperm development. ap2 mutant seeds undergo an extended period of rapid endosperm growth early in development relative to wild type. This early expanded growth period in ap2 seeds is associated with delayed endosperm cellularization and overgrowth of the endosperm central vacuole. The subsequent period of moderate endosperm growth is also extended in ap2 seeds largely due to persistent cell divisions at the endosperm periphery. The effect of AP2 on endosperm development is mediated by different mechanisms than parent-of-origin effects on seed size observed in interploidy crosses. Seed coat development is affected; integument cells of ap2 mutants are more elongated than wild type. endosperm overgrowth and/or integument cell elongation create a larger postfertilization embryo sac into which the ap2 embryo can grow. Morphological development of the embryo is initially delayed in ap2 compared with wild-type seeds, but ap2 embryos become larger than wild type after the bent-cotyledon stage of development. ap2 embryos are able to fill the enlarged postfertilization embryo sac, because they undergo extended periods of cell proliferation and seed filling. maternally acting AP2 influences development of the zygotic embryo and endosperm to repress seed size.

Statistical analyses indicated 262 candidate imprinted loci in the endosperm and three in the embryo (168 genic and 97 non-genic). Fifty-six of the 67 loci investigated were confirmed to be imprinted in the seed. Imprinted loci are not clustered in the rice genome as found in mammals. All of these imprinted loci were expressed in the endosperm, and one of these was also imprinted in the embryo, confirming that in both rice and Arabidopsis imprinted expression is primarily confined to the endosperm. Some rice imprinted genes were also expressed in vegetative tissues, indicating that they have additional roles in plant growth. Comparison of candidate imprinted genes found in rice with imprinted candidate loci obtained from genome-wide surveys of imprinted genes in Arabidopsis to date shows a low degree of conservation, suggesting that imprinting has evolved independently

Endosperm and embryo development are coordinated via epigenetic regulation and signaling between these tissues. In maize (Zea mays), the endosperm cellularization is a key event for embryos to form shoots and roots. The wild-type RGH3 allele is required in the endosperm for embryos to develop and has an autonomous role in embryo and seedling development. Endosperm cell differentiation is defective in rgh3. rgh3 mutants remain in a proliferative state through mid-seed development. Rgh3 encodes the maize U2AF35 Related Protein (URP), an RNA splicing factor involved in both U2 and U12 splicing. The Rgh3 allele produces at least 19 alternative splice variants with only one isoform encoding a full-length ortholog to URP. The full-length RGH3a isoform localizes to the nucleolus and displays a speckled pattern within the nucleoplasm, and RGH3a colocalizes with U2AF65. differentiation of maize endosperm cell types is necessary for embryos to develop. alternative RNA splicing is needed for cell differentiation, development, and plant viability.

四、胚乳发育中转录的基因种类 对发育中拟南芥胚乳的转录组学研究揭示了细胞分裂、细胞分裂素信号传导、基因表达调控等生物学活性在胚乳发育中起着作用。偏向在胚乳中表达的与细胞周期有关的基因有CYCB 类和A类蛋白、周期蛋白依赖的激酶、E2F类转录因子。在胚乳表达的、具有M期激活序列的启动子的基因有161个。胚乳中与植物激素乙烯、脱落酸、油菜类甾醇、细胞分裂素、生长素、甲基茉莉酸有关的基因中只有细胞分裂素反应有关的基因表达大大提高 。

943个差异表达的转录因子中，有187个倾向在胚乳中表达，71个倾向在早期胚乳表达。有12个MADS盒基因倾向在胚乳中表达，另外还有七个授粉后四天在胚乳中专一表达。球型胚阶段驱动倾向在合点端胚乳表达的启动子的基因有AGL38、ARR19，球型胚早期在合点端强表达以后扩散到胚乳其他部位的启动子有DOF4.5，以及其他合点端以及周围胚乳表达的启动子HSF14。然而这些基因的功能未知，有待进一步研究。

无融合生殖 植物有时不经过精卵细胞的融合产生有胚的种子，这种现象称为孤性生殖或无融合生殖（Apomixis），存在于40科以上的400多种植物中 。 一、无融合生殖的种类 无融合生殖现象中，母本种子的形成，没有父本基因组的参与，由仅含母本基因组的细胞发育形成。根据形成胚的细胞是否经过减数分裂，可分为孢子体无融合生殖和配子体无融合生殖。

在孢子体无融合生殖中，大孢子母细胞（MMC）直接进行有丝分裂形成胚囊，胚囊中的卵细胞发育形成2倍体胚，胚乳或受精或不受精。这样由孢子发育形成胚的生殖方式称为二倍体孢子无融合生殖（Diplospory） 。 此外孢子退化，由珠心细胞发育形成的胚的方式称为无孢子生殖（apospory），由胚珠珠被和其他孢子体细胞发育形成的也是完整的母本孢子体2n基因组，称为不定胚生殖（Advantive embryony） 。 配子体无融合生殖中，孢子母细胞经过减数分裂，其中一个孢子进行有丝分裂形成胚囊。配子体无融合生殖的种子几乎都是多倍体，也有二倍体的报道。配子体无融合生殖多倍体多的原因之一，可能是由于无性生殖本来就很少，多倍体在许多系统增强无融合生殖的表达 。

二、无融合生殖相关基因的研究 无融合生殖的根本是未受精细胞发育形成胚，一些与胚发育有关的基因的突变造成未受精状态下胚的发育。

信号传导相关基因 野生型胚的发育是在受精后接受信号传导然后启动胚发生，感受受精信号的受体发生突变会造成无信号下胚的发生。 胡萝卜、拟南芥、玉米、苜蓿、向日葵、草地早熟禾、水稻等植物中存在一种体细胞胚发生相关类受体激酶（Somatic embryogenesis receptor-like kinase, SERK），其基因具有相似的内含子/外显子结构，有一个信号肽序列（Signal peptide, SP）、1个ZIP、5个LRR、和一个富含脯氨酸序列（prolin rich region），多数N端有一段疏水信号肽。SERK是小基因家族成员，数目不多但不是唯一，在胚性细胞中表达，不同类型的SERK基因在功能上可能有不同。拟南芥SERK1参与胚胎发育过程的信号传导，SERK2、SERK3参与油菜素内酯的沉积和信号传导。水稻SERK1被病菌、ABA、水杨酸等逆境信号诱导和激活，过量表达可提高对稻瘟病的抗性。SERK的失活导致种子不能形成，可能与胚的诱导发育有关 。

胚专一表达的转录因子 一些转录因子在发育中胚和胚乳中专一表达，决定胚和胚乳的特性，如LEC(Leafy cotyledon)、BBM（Baby boom）、PGA6/WUS(Plant growth activator 6/)基因。LEC1基因可以诱导胚特异性基因的表达和胚结构的起始，也是种子成熟的重要调控因子。LEC2对胚发生的诱导与生长素的诱导无关 。 BBM诱导体细胞胚和子叶结构的形成，组织依赖性地激活细胞分裂增殖途径，可以诱导外植体形成胚性愈伤组织。WUS决定干细胞特性，可以在无生长素存在的体外培养条件下诱导体细胞胚的形成。

与减数分裂相关基因 影响减数分裂的基因能影响单倍体大孢子的形成，如SWI1、SPL/NZZ基因。减数分裂基因突变影响孢子囊和孢子的形成，但无融合生殖的无孢子生殖和不定胚发生不经过大孢子母细胞和减数分裂，形成体细胞基因型的胚和胚乳。 无融合生殖的机理很复杂，有很多问题需要阐明。无融合生殖的研究能为农业生产提供品种保存、基因选择等提供有利的技术和方法。