基因片段与载体连接及重组子的转化 邱逸敏 基因工程与发酵工程教研室

基因片段与载体连接

一、实验目的及背景 当我们已经获得目的基因片段，选择好适当的克隆（或表达，转化）质粒载体， 并确定重组方案后，下面要进行的就是DNA片段之间的体外连接，从而获得重组子。 此重组子可转入相应的宿主菌中用于对目的基因的扩增以及目的基因表达（如现代基因工程药物的生产），还可用于序列分析和转基因等重要生物技术的研究中。

二、DNA分子的体外连接原理 DNA分子的体外连接就是在一定条件下， 由DNA连接酶催化两个双链DNA片段组邻的５’端磷酸与３’端羟基之间形成磷酸酸脂键的生物化学过程， DNA分子的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列（粘性末端）基础上进行的。

连接反应中值得注意的几个问题： 1.DNA连接酶 常用的DNA连接酶有两种： (1)来自大肠杆菌的DNA连接酶 二者的作用机理类似。 两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。 T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断

T4 DNA连接酶作用机制 Ｔ4连接酶作用分三步： １．Ｔ4 DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶－AMP复合物。 ２． 酶－AMP复合物结合到具有５’－磷酸基和３’－羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化。 ３．产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来.

普通Taq酶会在3´末端加一个A，这样所有PCR产物都会在双链DNA的3´端均有一个单链状态的A； T－载体是线状DNA片段，在DNA双链的3´端均有一个单链状态的T； 二者在连接酶的作用下连接为一个重组的环状分子，从而达到克隆的目的。

2.连接反应的温度 DNA连接酶的最适反应温度为37℃， 但在此温度下， 粘性末端的氢键结合很不稳定，折衷方法是16℃。 很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3’端加上一个突出的碱基A。pUCm-T载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3’端带有一个突出的T。这样，pUCm-T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对，在连接酶的催化下，就可以把PCR产物连接到pUCm-T载体中，形成含有目的片断的重组载体。 连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度，即12-16℃，连接12-16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。

3. DNA的平未端和粘性末端 由于内切酶产生的DNA末端有平未端和粘性末端，因而连接反应中就有平未端连接和粘性末端连接。 二者连接效率不同。 粘性末端效率高，因而在底物浓度，酶浓度选择上是有差异的，

4.碱性磷酸酶处理质粒载体 为了提高连接效率，一般采取提高DNA的浓度，增加重组子比例。这样就会出现DNA自生连接问题， 为此通常选择对质粒载体用碱性磷酸酶处理，除去其５’末端的磷酸基，防止环化， 通过接反应后形成的缺口可在转化细胞后得以修复。

5.连接反应的检测 连接反应成功与否，最后的检测要通过下一步实验，转化宿主菌， 阳性克隆的筛选来确定。 我们下面的实验从粘性末端操作。

三、实验试剂 １．纯化后的酶切质粒载体和目的基因。 ２．１０×Ｔ4 DNA连接酶buffer 200mM Tris-HCl(pH7.6) 50mM MgCl2 50mM 二硫苄糖醇 500μl/ml BSA ３．Ｔ4 DNA连接酶 ４．5mM ATP

四、实验方法 DNA分子的体外连接 １．在无菌Eppendorf管中加入以下溶液： ２．盖上管盖，充分混匀，台式离心扣上离心５秒。 10×T4 DNA Ligase Buffer 1 ul DNA片段 约0.3pmol 载体DNA 约0.03pmol T4 DNA Ligase 0.4ul dH2O up to 10ul ２．盖上管盖，充分混匀，台式离心扣上离心５秒。 ３．１6℃下连接反应30min。 ４．反应结束后进行转化。

DNA分子的体外连接： 阳性对照：

五、结果与分析 １．如何判断连接效果的成功性？

问题与讨论： １．简述Ｔ4 DNA 连接酶作用机理。 ２．简述一个完整外源 DNA的克隆过程。 ３．连接反应中应注意些什么问题及如何提高连接效率。

重组子的转化

一、DNA的转化及转化子的筛选 ——实验目的及背景 体外通过基因工程手段所构建的含目的基因的重组质粒，选用转化和筛选技术， 可获得含重组的阳性克隆。在此阳性克隆中，DNA可在生物体系中大量扩增，繁殖， 保存以及表达目的基因的产物，这是PCR体外扩增DNA所不能替代的。配合DNA重组技术，所获得的，不同目的需要的阳性菌株已广泛应用于科研，医药生产和生物发酵等领域。

二、原理--本实验由二个方面组成: 1. 质粒DNA转化大肠杆菌。 质粒转化不同细菌有不同的转化效率，转化效率的高低与实验的成败直接相关， 通常转化效率可达105－107转化子/μg DNA。 获得高转化效率的关键是感受态体菌的制备。

现在制备感受态细胞通常用CaCl2处理，在低温中与外来DNA分子相混合. ４．表达一供体基因随同复制子同时复制，分裂， 转录翻译。

重组子的筛选 这和受体菌：质粒DNA的选择相关， 原则上要注意： １．受体菌必须是限制与修饰系统缺陷的菌株； ２． 根据质粒基因型和受体菌基因型互补原则而定。 重组子的筛选方法常用的有两种方法：

１．抗生素筛选法 菌株为某种抗生缺陷型， 而质粒上带有该抗性基因（如氨苄青霉素， 卡拉霉素等）这样只有转化子才能在含该抗生素的培养基上长出。 本实验利用抗生筛选转化子。

２互补法 现在使用的许多载体（如ＰＵＣ系列）有含有一个大肠杆菌ＤＮＡ的短区段，其中含有β－半乳糖苷酸基因（lacZ）的调控序列和头１４６个氨基酸编码区。这个偏码区中插入一个多克隆位点。 受体菌则含编码β－半乳糖苷酶Ｃ端ａａ的序列。当外源基因插入时，二者溶为一体后，有β－半乳糖苷酶表达， 在生色底物５－溴－４－氯－３－吲哚－β－Ｄ－半乳糖苷（x-gal）培养基中形成蓝色菌落。 而当有外源基因插入到多克隆原点，从而造成插入失活，而使lacZ基因不表达而形成白色菌斑。 通过颜色不同而区分重组子和非重组子。

三、实验试剂 LB培养基 质粒ＤＮＡ（含Amp抗生基因），受体菌 CaCl2 0.1M Amp 、X-gal、IPTG

四、实验方法 1、每100µL感受态细胞悬液中加入10µL连接反应液。同时设置三组对照：(1)不加连接反应液（ddH2O替代），(2)不加受体菌， (3)加已知具有转化活性的质粒DNA。 2、冰上放置20～30min，然后42℃水浴热激45 Sec，迅速冰上冷却2min； 3、立即向上述Ep管中加入0.8mL LB液体培养基，摇匀后于37℃振荡培养约1h ，使受体菌恢复正常生长状态及表达抗性基因； 4、取培养液50µL接种于含抗菌素的LB平板培养基（提前倒好：含X-Gal、IPTG和Amp）上，用玻璃涂棒涂匀； 5、将培养皿放在超净台上，在无菌风下待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于37℃恒温培养箱内培养过夜(14-16h) ；

五、结果与分析讨论 １．计算转化率。 ２．根据转化率和阴性对照分析实验结果。 问题与讨论： １．根据本实验认为影响转化率的因素有哪些？ ２．抗性法筛选和互补筛选原理是什么？