人體尿液中 肌酸酐濃度的定量分析

一、臨床意義： 肌酸酐（Creatinine）為人體運動代謝後產物, 其測定數據用於診斷和治療腎臟疾病（尿毒症）, 監控腎透析（尿毒監控）,以及 作為其他尿液分析物測定資料的計算基礎 （其他疾病診斷）. 正常男性尿液：800～2000 mg/24hr 或7.1～17.7 mmoL/24hr 正常女性尿液：600～1800 mg/24hr 或5.3～15.9 mmoL/24hr 正常人尿液濃度：約在171～3915 ppm 之範圍內

二、原理： 1.此為以化學反應產生顏色來測定濃度之實驗： 故影響反應速率的因素,如－ 反應時間（定為15分鐘,使反應趨近於完全) 攪拌時間（用手旋轉分析試管均勻混合15圈） 反應溫度（室溫及恆溫,避免分析試管靠近灼熱燈光） 等因素 均需控制相同,數據才會準確. 林子樸：讀經日程， 大光宣叫福音基金會，1999年4-6月。 丁良才：經題模範卷10

二、原理： （續） 2.採用Jaffe’s法測定肌酸酐濃度： 在反應中,肌酸酐（無色）與 苦味酸（Picric acid,呈黃色,味苦） 在鹼性溶液（pH>13.3）中 結合成肌酸酐-苦味酸複合物 （呈橘紅色或橙色） 為避免細菌分解影響數據的準確性 應採集新鮮的尿液作樣品 巴刻J.I. Packer, Concise Theology簡明神學，p.163

二、原理：（續） 用可見光分光光度計 測定波長為500奈米（nm） 為可見光範圍 用壓克力玻璃液體樣品槽 即可測定肌酸酐濃度 3.橙色為可見光七種色光顏色之ㄧ: 用可見光分光光度計 測定波長為500奈米（nm） 為可見光範圍 用壓克力玻璃液體樣品槽 即可測定肌酸酐濃度 壓克力玻璃 液體樣品槽

二、原理：（續） 4.遵守比爾定律（Beer’s Law）： 在稀薄溶液（濃度＜20 ppm） 吸光度（Absorbance,簡寫A）與 即 A ＝εb C 可據此計算肌酸酐濃度

二、原理：（續） 5.用最小二乘法線性迴歸得檢量線方程式： 即A＝a + b × C A：吸光度 [－] C：肌酸酐濃度 [ppm] b：檢量線斜率＝（n∑CiAi－∑Ci∑Ai）/[n∑（Ci2）－(∑Ci）2] a：檢量線截距＝ (∑Ai－b ∑Ci) /n r：檢量線相關係數 r＝（∑CiAi－∑Ci∑Ai）/{[∑（Ci 2）－ (∑Ci）2] [∑（Ai 2）－ (∑Ai）2]}½

二、原理：（續） 6.用檢量線相關係數r值,判斷實驗準確度： 當r值愈趨近於1,表實驗數據與理論直線愈接近. 獲得 a、 b ,及 r 等數值.

三、儀器及藥品： 1.可見光分光光度計 1或2台 2.試管及橡皮塞 各7 3.有刻度移液滴管5mL及安全吸球 各1 1.可見光分光光度計 1或2台 2.試管及橡皮塞 各7 3.有刻度移液滴管5mL及安全吸球 各1 4.100mL、250mL及1L量瓶 各4、1、2支 5.苦味酸 6.酚酞 7.NaOH 8.肌酸酐 9.37％ HCl

四、反應試劑之製備： （請先由任課教師實驗前製備） 四、反應試劑之製備： （請先由任課教師實驗前製備） 1.0.75M之NaOH溶液 ： 稱取 30g 之NaOH 加入1L量瓶中, 加蒸餾水稀釋至1L , 並儲存於白色1L高密度聚乙烯瓶中. 2.0.1M之NaOH溶液： 取13.3mL 之1.加入100mL量瓶中 用蒸餾水稀釋至100mL. 林子樸：讀經日程， 大光宣叫福音基金會，1999年4-6月。

四、反應試劑之製備：（續） 3.0.04M苦味酸溶液： 稱取 9.3 g 之苦味酸（黃色） , 溶於約 80 ℃ 之 500 mL 水中冷卻後 , 加入幾滴 酚酞（無色）指示劑, 以 2.將之滴定至紅色 ,裝入 1L 量瓶, 再加 蒸餾水 稀釋到 1 L , 並儲存於 1 L 玻璃瓶中. 林子樸：讀經日程， 大光宣叫福音基金會，1999年4-6月。

四、反應試劑之製備：（續） 4.0.1M之HCl溶液： 取2.1mL之37﹪HCl稀釋至250mL量瓶中. 5.肌酸酐儲存標準液（1000ppm）： 稱取0.100g之肌酸酐, 用4.將肌酸酐溶於100mL量瓶中, 再以玻璃容器冷藏保存之. 林子樸：讀經日程， 大光宣叫福音基金會，1999年4-6月。

四、反應試劑之製備：（續） 6.肌酸酐實驗標準液（20ppm）： 用移液滴管取2mL之儲存標準液,即5., 以蒸餾水稀釋到100mL量瓶中, 即稀釋50倍. 用以繪製檢量線. 林子樸：讀經日程， 大光宣叫福音基金會，1999年4-6月。

五、實驗步驟： 1.分別用移液滴管取2 mL苦味酸,加入各試管： 試管a（未知尿液樣品肌酸酐濃度測定用） 試管B（Blank,空白試驗,光度計歸零用） 試管c（本試管及以下4支試管所測之濃度, 均用以繪製肌酸酐濃度檢量線） 試管d 、試管e 、試管f,及 試管g 中. 林子樸：讀經日程， 大光宣叫福音基金會，1999年4-6月。

五、實驗步驟：（續） 2.尿液稀釋樣品之製備： 可收集實驗同學自身尿液, 以有刻度移液滴管吸取尿液0.5mL裝入100mL量瓶, 於試管a（未知濃度）中, 加入前述尿稀釋液 5mL. 3.各種標準檢測濃度之製備： 於試管B（0ppm）中, 加入5.00mL蒸餾水. 於試管c（4ppm）中, 加入1.0mL肌酸酐標準液及4.00mL蒸餾水. 林子樸：讀經日程， 大光宣叫福音基金會，1999年4-6月。

五、實驗步驟：（續） 於試管d（8ppm）中, 加入2.0mL肌酸酐標準液及3.00 mL蒸餾水. 於試管e（12ppm）中, 於試管f（16ppm）中, 加入4.0mL肌酸酐標準液及1.00 mL蒸餾水. 於試管g（20ppm）中, 加入5.0mL肌酸酐標準液及0.00 mL蒸餾水. 林子樸：讀經日程， 大光宣叫福音基金會，1999年4-6月。

五、實驗步驟：（續） 4.取2 mL 0.75M之 NaOH溶液,加入試管a,即開始計時： ◎再每隔1分鐘,輪流加入 2mL 0.75M之 NaOH溶液 於 試管B 、 試管c 、 試管d、 試管e 、 試管f,及 試管g中. ※請注意,在 NaOH溶液加入各試管之後,需用手均勻旋轉攪拌每支試管15圈,以均勻混合檢測液.

五、實驗步驟：（續） 5.固定可見光光度計之測定波長於500nm, 用試管B之溶液為空白對照： ◎當計時15分鐘時,測定試管a之Aa值, ◎再每隔1分鐘,輪流連續測定其他試管的吸光度, 即AB＝0.000、Ac 、 Ad 、 Ae 、 Af 、 Ag 之值. ※注意：分析時,可用測定之試管溶液自己洗自己.

六、結果： □ 1.表1：檢量線數據－ 4 8 12 16 20 濃度Ci 0.000 (Ai) 吸光度 （Aa） （ppm） 未知尿液 4 8 12 16 20 吸光度 (Ai) □ （Aa） 0.000 （AB） （Ac） （Ad） （Ae） （Af） （Ag）

2.圖1：檢量線圖形 2.0 A 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 濃度C（ppm）

3.利用最小二乘法線性迴歸 所得檢量線方程式： 3.利用最小二乘法線性迴歸 所得檢量線方程式： ◎A＝a + b × C a＝______________ b＝______________ r＝______________ ◎實際尿液濃度＝╴╴╴╴╴ ppm 註：實際尿液濃度為未知液檢測濃度的200倍, 亦即檢量線所得未知尿液濃度需×200.

七、討論： ◎並請寫下－ 您的感想及心得. Thank you for attention !