蛋白质组学中的双杂交 马萍 2009.4.22

随着对多种重要生物的大规模基因组测序工作的完成，基因工程领域又迎来了功能基因组时代。生物体系的运作与蛋白质之间的互作密不可分，蛋白与蛋白间相互作用几乎调节每个生命过程 。

蛋白间相互作用的意义及应用 结构蛋白的相互作用对细胞形态的维持（纤维蛋白 ） 蛋白质代谢、修饰中的作用 （蛋白质可逆磷酸化 ） 信号转导与识别 （cAMP信号通路 ） 形成复杂的蛋白质复合物 （DNA复制、转录，蛋白质翻译） 筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响 整个蛋白质组中蛋白间相互作用的网络图绘制（困难的工作）

应用最广泛、最成功的评价蛋白相互作用的方法是酵母双杂交系统。 概念最初是Stanley Fields提出的，酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识 。利用真核转录因子和酵母（酿酒酵母）强大的遗传学背景来检测蛋白相互作用。

bait protein prey protein β-gal

主要内容 基于酵母双杂交的相互作用组学的研究 其他的酵母双杂交衍生的技术 哺乳动物双杂交系统 酵母双杂交在药物运载的应用 双杂交在相互作用位点图谱绘制的应用 结论和展望

基于酵母双杂交的相互作用组学的研究 随着酵母大规模蛋白质相互作用网络图谱的成功描绘，蛋白质相互作用特别是大规模蛋白质相互作用研究成为生命科学领域的又一个研究热点。酵母、果蝇、线虫以及人类蛋白的大规模相互作用图谱的相继完成，不仅对系统研究细胞内各种生命活动有着重要意义，也标志着蛋白质相互作用研究方法的不断发展和完善。

特殊途径或疾病因素的酵母双杂交筛选系统（深入） 例如：寻找与亨廷顿相互作用的神经退行性变的遗传修饰因子，与几个已知的遗传共济失调相关的蛋白的相互作用子 人类核激素受体和它的辅助因子间的相互作用网络 促进蛋白相互作用的核受体的小分子配体 研究低等动物的特殊途径和功能 大规模的酵母双杂交—有丝分裂纺锤体相关蛋白的功能和与其他细胞活动的联系

限制和挑战 相互作用网络的形成需要耗费大量的人力和物力 （混合共用和重叠合成法 ） 假阳性和假阴性的频繁的发生 假阴性是真正的相互作用但在筛选的过程中没有检测到，由核定位或融合蛋白不正确的折叠引起。 假阳性的主要来源是异源蛋白的过量表达引起的不相干的相互作用和无需与诱饵蛋白结合就能诱导报告基因的转录（25%-45% ）。 消除：生物信息学系统追踪方法

其他的酵母双杂交衍生的技术

膜酵母双杂交系统 （MYTH） 诱饵蛋白 猎物蛋白 疏水特性和无核定位 泛素分裂 内源 泛素特异性蛋白酶 酵母ABC转运子Ycf1p的六个新的相互作用蛋白 cDNA文库和阵列筛选 Wnt-信号通路组分的新的相互作用蛋白

细胞质酵母双杂交系统 (cytoYTH) 基于泛素分裂的原理 应用在核环境中很难研究的蛋白 间隔特异性的酵母双杂交 细胞质的诱饵蛋白绑定在Ost4p（一个小的酵母内质网整合膜蛋白），限制了在细胞质中诱饵蛋白和猎物蛋白相互作用。 应用在核环境中很难研究的蛋白 间隔特异性的酵母双杂交 其他例如抑制转活系统的方法和基于RNA-聚合酶III系统的方法

哺乳动物双杂交系统 期望在人类蛋白质相互作用系统中能产生更加可靠和环境特异性的结果 很难大规模的筛选 用于操作哺乳动物细胞系的改进的方法，如慢病毒载体，和用阵列格式平行分析人类细胞的快速进展能考虑到在系统生物学的哺乳动物双杂交系统的未来应用。 蛋白片段隔离的方法被广泛应用到大规模的分析，而且在药物运载和蛋白质工程还有很大的潜能

烟草花叶病毒的断裂（Split-TEV system） 诱饵-猎物蛋白相互作用引起的烟草花叶病毒蛋白酶的功能互补。 在重建时，烟草花叶病毒断裂一个识别序列并释放一个报告蛋白，该蛋白或者是转录因子或者是荧光酶 TEV蛋白酶——剪刀 膜蛋白和细胞质蛋白的相互作用 优点：断裂的不可逆性产生了一个稳定的永久关于短暂的蛋白相互作用的结果。

哺乳蛋白相互作用陷阱（MAPPIT系统 ） STAT3转录因子 细胞因子受体突变体 STAT3停泊位点 磷酸 JAK-STAT信号通路 诱饵和猎物蛋白相互作用恢复了在胞浆中的配体依赖的细胞因子受体信号通路机制 分析信号通路中蛋白相互作用

酵母双杂交在药物运载的应用 可逆的酵母双杂交系统和酵母三杂交系统，可用来评价生理环境下小分子与蛋白间的相互作用。 在药物运载上的应用至今还被技术困难和已经确定的其他方法所阻碍，技术改进和较好的筛选平台将会有更加广泛的应用。

可逆酵母双杂交（rYTH） 反向选择策略，利用了已经确立的能够导致细胞生活力的蛋白相互作用系统的分裂 能抑制诱饵-猎物蛋白相互作用的小分子能拯救在有毒代谢产物存在的细胞活力 酵母URA3基因被用作反向选择标志，由于该基因的产物能将5-氟-乳清酸转化成能导致细胞死亡的有毒的代谢产物。 对于能够引发疾病反应的蛋白互作可以采取药物干扰的方法，阻止它们的相互作用以达到治疗疾病的目的。

酵母三杂交（Y3H） 在体内筛选与特异小分子相互作用的蛋白 最初分析蛋白和RNA间的相互作用也可筛选诱饵蛋白展示的小分子与猎物蛋白相互作用 基本原理:将一个已知的RNA结合蛋白与DBD(如LexA)构建第一个融合蛋白，第二种蛋白(待选的RNA结合蛋白)与AD构建融合蛋白，再构建和表达一杂合RNA，含有二个不同的结合位点。当RNA与二个RNA结合蛋白的结合位点相互作用时可激活报道基因的转录和表达。 大规模的应用中，用来研究人类的周期依赖性蛋白激酶抑制剂的靶向。 新的三杂交技术，基于泛素断裂系统，分析蛋白和小分子间相互作用。

双杂交在相互作用位点图谱绘制的应用 随机诱变和可逆酵母双杂交筛选绘制蛋白相互作用位点图谱 主要缺点是大多数的突变会产生截断或关于蛋白相互作用无意义的错误折叠 通过易错PCR对随机诱变最优化和酵母双杂交挑选能更好的描述蛋白相互作用界面中的分子识别 绘制出了DNA甲基转移酶的催化域和它的调节因子作用的界面

结论和展望 酵母单杂交—核酸和文库蛋白之间的研究 酵母三杂交—三种不同蛋白之间的互作研究 酵母反向杂交技术—两种蛋白相互作用的结构和位点 膜酵母双杂交 、细胞质酵母双杂交、哺乳双杂交 蛋白相互作用组学网络、药物载体、筛选新药 联合双杂交筛选程序和高通量DNA分析的应用，如DNA微阵列或新兴的测序技术，能将通过双杂交方法分析相互作用组学提高到一个整体的新的水平。

细菌双杂交与酵母双杂交比较 传统酵母双杂交系统 细菌双杂交系统 细菌杂交系统能更灵敏检测难发现特定蛋白结合体 传统酵母双杂交系统 细菌双杂交系统 生长时间 6天 1天或过夜培养 转化率 106 109 DNA操作过程 额外转化过程到E.coli 直接克隆筛选 DNA分离 酵母染色体DNA与质粒共沉淀 简单、方便的制备 （去除了一步转化） 克隆分析 繁琐的纯化后进行 直接进行 结果评价 假阳性多 假阳性少 细菌杂交系统能更灵敏检测难发现特定蛋白结合体 对待测蛋白的特性要求低，因此可适合更大蛋白库筛选

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