荧光衍生试剂在高效液相色谱和电泳中的应用 导 师：张玉奎 学 生：张 琳 各位老师同学大家好，我的seminar 的题目是荧光衍生试剂在高效液相色谱和电泳中的应用。 中科院大连化学物理研究所1810组

汇报内容 引言 常用荧光衍生化试剂应用简介         展望

引 言 衍生的目的 衍生发应方式 荧光衍生试剂的构成 引 言 衍生的目的 衍生发应方式 荧光衍生试剂的构成 高效液相色谱和电泳作为分析技术不像气相色谱那样，具有较灵敏的通用检测器如氢火焰离子化检测器，热导检测器和电子捕获检测器等。示差折光检测器虽然较为通用，可是检测灵敏度低，满足不了微量物质检测的需要 （mg/L），质谱对于HPLC和CE是一种灵敏和通用的检测器，但由于价格昂贵还不能普及。广泛采用的UV检测器（0.1 mg/L），可对某些含有生色团的化合物进行测定，虽然有一定的灵敏度，但检测限显得过高。荧光检测器比起紫外吸收检测器要灵敏得多，但要求被检测样品能被激发产生荧光，对于不发荧光或荧光较弱的样品灵敏度很低，甚至不能检测。为了扩大其在高效液相色谱和电泳中的应用范围，提高检测灵敏度和改善分离效果，采用化学衍生法是一个行之有效的途径。

衍生化反应方式 从是否形成共价键来分 从是否与仪器联机的角度来分 从衍生反应的场所来分 标记 非标记 在线 (on line) 离线 (off line) 从是否与仪器联机的角度来分 柱前衍生化 (pre-column derivatization) 柱上衍生化 (on-column derivatization) 柱后衍生化 (post-column derivatization) 目前在ＨＰＬＣ中以离线的柱前衍生法(简称柱前衍生法)与在线的柱后衍生法(简称柱后衍生法)使用居多。 柱前衍生化是应用最为广泛的一种衍生技术，自由性大，离线更利于优化反应条件 在色谱分离前，样品组分经过特定的化学反应，使之转变为荧光衍生物进而进行色谱分离测定，该方法的优点表现在以下几方面：(1)通常不考虑衍生化反应的动力学，直到衍生反应完全。(2)为了使衍生反应及衍生产率获得最佳效果，可以任意选定衍生化条件。(3)柱前衍生化反应的溶剂不必与分离时的流动相配伍。(4)衍生化的副产物可进行预处理以降低或消除其干扰。其主要缺点表现在：(1)柱前衍生化反应形成的副产物可能对色谱分离造成较大难度，有时严重影响衍生化反应的重复性。(2)衍生物的降解，反应溶剂的杂质组分造成大量干扰峰。 从衍生反应的场所来分

荧光衍生试剂的基本构成 取代基 荧光团（试剂分子母体） 反应基团 胆磺酰肼 DNS-H 要求衍生试剂具有与被衍生物反应生成稳定共价键结合物 衍生的主要目的是提高检测灵敏度，所以衍生试剂必须含有可检测的基团，对于荧光衍生试剂，荧光 团就是衍生试剂分子母体，一个好的衍生试剂还要具备较好的溶解性，试剂本身或其衍生物应含有水溶性基团，-SO3H, -COOH, -OH,等及易成氢键的原子，如O,N 或基团，这样易于分离和不会“塞柱”。 根据不同的衍生反应方式，对衍生试剂要求也不同。 对于柱前1一种衍生物2较高的衍生产率3试剂用量少，避免试剂峰的干扰 对于柱后1试剂与被分析反应迅速2衍生试剂转化率高，过量少 胆磺酰肼 DNS-H

I 胺类化合物的衍生试剂 邻苯二甲醛(OPA) 芴代甲氧基酰氯(FMOC) 6-氨喹啉基琥珀酰亚胺碳酸酯(AQC) 芳香邻二醛类 OPA 异硫氰酸酯类 FITC 酰氯类 FMOC 活性卤类 NBD-Cl N-羟基琥珀酰亚胺活性酯类 AQC 邻苯二甲醛(OPA) 荧光素异硫氰酸酯（FITC) 芴代甲氧基酰氯(FMOC) 4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并恶二唑 (NBD-Cl) 6-氨喹啉基琥珀酰亚胺碳酸酯(AQC) Opa FITC FMOC NBD AQC

常用胺的衍生试剂 分子式 邻苯二甲醛 OPA 4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并恶二唑 NBD-Cl 荧光素异硫氰酸酯FITC AQC 250 395 nm 荧光素异硫氰酸酯FITC FMOC芴代甲氧基酰氯 6-氨喹啉基琥珀酰亚胺碳酸酯AQC

邻苯二甲醛 OPA 衍生分离氨基酸的色谱图 J Chromatorgr. 1990,499:557

集成化微流控芯片氨基酸分析仪 高等学校化学学报 2004, 25: 189~190 这是浙江大学化学系微分析系统研究所集成化微流控芯片氨基酸分析仪 其中用到的荧光衍生试剂为 FITC，主要特点是试剂的最大激发波长与Ar+激光诱导荧光检测器相匹配 488 nm 芯片毛细管电泳分离多种FITC衍生的氨基酸 高等学校化学学报 2004, 25: 189~190 浙江大学化学系微分析系统研究所 方群 方肇伦 高等学校化学学报 2004, 25: 189~190

FMOC 衍生分离氨基酸的色谱图 J Chromatorgr. 1990,499:557

FMOC与CEOC衍生分离氨基酸的比较 Anal. Biochem 2003,313 17~27 对于色氨酸和半胱氨酸的CEOC 衍生物的稳定性和检测相应明显优于FMOC的衍生产物 Anal. Biochem 2003,313 17~27

FMOC与CEOC衍生分离脂肪胺的比较 图2 FMOC 衍生胺类化合物色谱分离图（23种）

1-乙氧基-4-(二氯-三嗪)萘（EDTN） II 醇、酚的衍生试剂 羰基氯类： FMOC CEOC 磺酰氯类: DNs-Cl 卤代三嗪类: EDTN 在水溶液中，对于醇没有选择性的衍生试剂特别是在具有较大亲核反应活性的胺和硫醇反应的试剂可以用来衍生醇。 1-乙氧基-4-(二氯-S-三嗪)萘（EDTN) 1-乙氧基-4-(二氯-三嗪)萘（EDTN）

CEOC 衍生醇类荧光检测色谱分离 这是CEOC衍生分离15种脂肪醇类化合物的色谱图 分析化学 2003, 31, 62~65

CEOC 衍生酚类荧光检测色谱分离 1.苯酚 2.对氯苯酚 3. 2,5-二甲基苯酚 4. 2,4-二氯苯酚 5. 1,4对苯二酚 1.苯酚 2.对氯苯酚 3. 2,5-二甲基苯酚 4. 2,4-二氯苯酚 5. 1,4对苯二酚

III 羰基化合物的衍生试剂 肼类 DNs-H CEOC-H 氨基类 氨基甲基芘 含有羰基的化合物一般来说是醛或酮，或含有醛基和酮基的化合物如：糖 按照有机反应的规律，含有肼基（NH-NH2）和（-NH2）的化合物易与其发生缩合

肼和胺与羰基化合物的反应 含有羰基的化合物一般来说是醛或酮，或含有醛基和酮基的化合物如：糖 按照有机反应的规律，含有肼基（NH-NH2）和（-NH2）的化合物易与其发生缩合

咔唑-9-乙氧基羰基肼(CEOC-H)柱前衍生中性糖高效液相色谱分离 糖类化合物没有紫外吸收，而且亲水性很强，在一般反相柱上较难分离，通过荧光衍生化反应则可以解决这一问题 这是采用咔唑-9-乙氧基羰基肼来衍生5种糖类化合物的衍生分离色谱图 (FL detection) 1.乳糖 2.甘露糖 3.葡萄糖 4.鼠李糖 5. 山梨糖

IV 羧酸类化合物的衍生试剂 (4-溴甲基-7-甲氧基香豆素) 溴甲基类 BrMMC 哌嗪基类 DBD-Pz 重氮甲烷基类 ADAM 其它类 9-蒽重氮甲烷 7-N-哌嗪-4-二甲氨基苯并呋喃 7-N-哌嗪-4-二甲氨基苯并呋喃 4-氨甲基-6，7-二甲基香豆素 (ADMC) 9-蒽重氮甲烷 9-蒽重氮甲烷 4-氨甲基-6，7-二甲基香豆素 (ADMC) 9-(2-羟乙基)-吖啶酮 HEA

荧光衍生试剂与羧酸的反应 这是荧光衍生试剂与羧基衍生反应的示意图

4-氨甲基-6,7-二甲基香豆素 (ADMC) 衍生羧酸 色谱分离图 Anal.Sci.1996,12:189 Anal.Sci.1996,12:189

9-(2-羟乙基)-吖啶酮 HEA 衍生胆汁酸 色谱分离图 采用一种新型紫外、荧光衍生试剂9-(2-羟乙基)-吖啶酮（HEA），在缩合剂1-(3-二甲氨丙基)-3-乙基碳酰二亚胺(EDC)及碱性催化剂4-二甲胺基吡啶(DMAP)的存在下，对10种胆汁酸进行柱前衍生，并通过荧光检测的方法进行高效液相色谱(HPLC)分析。 Fig.1 胆汁酸分离色谱图（荧光检测）. 衍生物的激发和发射波长分别为 ex=404, em=440nm

V 分离对映体的手性荧光衍生试剂 手性衍生试剂除了具有一般荧光衍生试剂所备的反应基团和荧光基团外，必须是旋光的 另外，。 化学衍生法将对映体转化成一对非对映体 进而在普通非手性柱上分离

手性荧光衍生试剂 R(-)DBD-PyNCS 衍生分离DL氨基酸 R(2)-4-(3-isothiocyanatopyrrolidin-1-yl)-7-(N,Ndimethylaminosulfonyl)- 2,1,3-benzoxadiazole, 该种类型的荧光衍生试剂日本的Toyo’oka 研究的比较多一点 J.C.A 1998 822 215~224 Toshimasa Toyo’oka Japan J.C.A 1998 822 215~224

N-异丁酰基-D(L)-半胱氨酸 (IBDC和IBLC) OPA 与手性硫醇 衍生分离DL氨基酸 另外，采用各种手性硫醇和OPA衍生分离手性氨基酸研究也较多 N-异丁酰基-D(L)-半胱氨酸 (IBDC和IBLC) HPLC N-异丁酰基-D(L)-半胱氨酸 (IBDC和IBLC) J.C.A 1999 832 123

VI 蛋白质的衍生试剂 目前常用衍生蛋白质的荧光标记试剂有： 邻苯二甲醛 (OPA) 4-氟-7-硝基苯并恶二唑 (NBD-F) 荧光素异硫氰酸酯 (FITC) 3-呋喃甲酰喹啉-2-羰醛 (FQ) 蛋白质的快速及有效的分离和高灵敏检测，仍然是目前研究的热点。 OPA He-Cd 激光光源 325 456 nm 10-9 mol/L 室温 30 min FITC Ar+ 488 nm 514 nm 25 度 3.5 h NBD-F Ar+ 488 nm 520 nm 50 度 5 min FQ 488 NM 10 min

邻苯二甲醛 OPA 衍生马心肌红蛋白质毛细管电泳分离 J.Am.Chem.Soc. 1995,117:3325 这是邻苯二甲醛 OPA 衍生马心肌红蛋白质毛细管电泳分离图，问题是蛋白质的柱前衍生存在多级衍生的问题 选择标记蛋白质的荧光衍生试剂和衍生方式或者控制反应条件，将可能大大减少蛋白质分子的多级衍生和背景 荧光的干扰，提高检测灵敏度，采用柱后衍生可以使分离后的各组分分别衍生，避免多级衍生物的分离及相互干 扰 Fig.5 OPA 柱后标记马心肌红蛋白质毛细管电泳图 J.Am.Chem.Soc. 1995,117:3325

3-呋喃甲酰喹啉-2-羰醛 FQ 衍生蛋白质毛细管电泳分离 J.Am.Chem.Soc. 1989,111: 5008 Dovichi 等 采用FQ为荧光衍生试剂，柱前衍生，毛细管电泳分离激光诱导荧光检测，分离测定了肌红蛋白 碳酸酐酶、卵清蛋白、BSA,检测浓度达 10-10 mol/L J.Am.Chem.Soc. 1989,111: 5008

VII 核酸的衍生试剂 在电泳分离荧光法检测DNA序列分析中，通常分4组（A,C,G,T体系）进行，如果用四种不同的荧光染料为探针，标记一个共同的引物，分别用在A,C,G,T 四个反应体系中，等于用不同的探针专一地标记了不同的碱基，利用各荧光探针的荧光光谱的差别便可以把不同的碱基区分开。 4-氟-7-硝基-2,1,3-苯并恶二唑 NBD-F Nature 1986,327: 674 DNA序列分析中所用的四种荧光衍生试剂 Nature 1986,327: 674

DNA 测序仪及电泳图

展 望 分析化学中的有机试剂在分析化学中占有与分析仪器同等重要的地位，荧光衍生化试剂则是有机分析试剂的一类重要分支。 性能优良的荧光衍生化试剂可能将成为某些物质的高灵敏 高选择性分析的关键，荧光衍生试剂的开发与应用也正朝这个方向发展。 在实际工作中将可能遇到各种现有荧光衍生试剂所不能解决或不能很好解决的问题。 有必要根据实际工作的需要来开发研究新型的荧光衍生试剂 被测定物质和一个适宜试剂的化学反应仍然是许多分离、检出和测定方法的基础 荧光衍生试剂的开发与应用正朝着高灵敏、高选择性的方向发展 近红外荧光衍生试剂 提高选择性标记荧光试剂 提高光稳定性 自动化

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