RT-PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction 1， RNA 的提取 2，逆转录 3，PCR What is reverse transcribed or which kind of RNA is reverse transcribed ? mRNA Why mRNA can not be used as template in PCR directly?

How to do reverse transcription DNA链的延伸需要引物的触发 ◆ mRNA has a 3’ poly A tail 5' AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 3’ ◆ Oligo dT used as primer 5’ TTTTTTTTTTTTTTTTTT 3’ ◆ dNTPs is materials ◆Reverse Transcriptase must be used.

Why we perform RT-PCR? 1, 真核基因多是断裂基因。 我们所进行的实验是围绕着一个中心所展开的——gene 1, 真核基因多是断裂基因。 我们所进行的实验是围绕着一个中心所展开的——gene engineering

基因工程过程示意图 ③ ① ④ ② ⑤ ⑥ 返 回 ①从细胞中分离出DNA ②限制酶截取DNA片断 ③分离大肠杆菌中的质粒 ④ DNA重组 ⑤用重组质粒转化大肠杆菌 ⑥培养大肠杆菌克隆大量基因 返 回 克隆入表达载体内的基因必须是适于表达的

内含子（intron）：不为蛋白质编码的间隔序列。 外显子(exon)： 编码蛋白质的序列 5’flanking exon 1 intron 1 exon 2 intron 2 exon 3 3’ flanking 初级转录本 成熟mRNA 剪切、拼接 翻译

2，可以利用mRNA定量检测基因的表达水平。 Protein水平的检测：采用生化或免疫的方式 需要相应的底物or 抗体 mRNA水平的检测更直接，也具有更广阔的适用性。

Probe:能与特定的靶分子发生特异性相互作用的分子并可以被特殊的方法所识别。 最经典的mRNA定量方法： Northern blot :针对RNA 的印迹过程。 （1）提取组织总RNA （2）电泳对RNA条带进行分离。 （3）将RNA条带转移至支持物（硝酸纤维素膜）上。 （4）制备探针（probe）并进行杂交 Probe:能与特定的靶分子发生特异性相互作用的分子并可以被特殊的方法所识别。 （5）放射性自显影或显色。 注：只能对序列已知的基因进行测定。 如进行mRNA量的分析则应具备内参照。

实验操作： 1）RNA的电泳分离

Membrane Transfer

标记探针与膜固相RNA杂交。 根据杂交信号强弱判断表达量， 根据杂交信号位置判断分子大小。 杂交信号 注：所有的mRNA定量方式均需要有内参照。

mRNA cDNA PCR产物 逆转录 PCR PCR的产物量与mRNA的量是正相关的

半定量PCR检测特定基因的表达水平： 1，提取样品总RNA。 2，RT-PCR扩增待测基因及作为内参照的管家基因。 3，待测基因及管家基因PCR产物的电泳分离。 4，计算待测基因/管家基因的光密度值。 PCR产物与模板的正相关并不是永远存在的，只是在PCR的指数期才满足。

定量PCR（realtime PCR）:   所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 用于realtime PCR的荧光探针。 特异的DNA序列

为了节省实验经费realtime PCR也可不采用TaqMAN探针而采用荧光染料掺入的方式。 特异性及灵敏性都会降低。 提取RNA时需要注意的问题： 避免RNase对RNA的降解 RNA酶广泛存在而稳定，不需要辅助因子。因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA的降解。 一方面要严格控制外源性RNA酶的污染 另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。

外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中 常用的RNA酶抑制剂 1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。 2. 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。 3. RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。

防止RNA酶污染的措施 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。 2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗。 3. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。 4. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。

RNA提取的步骤： 1，细胞的裂解 2，蛋白质的去除 3，核糖核酸的沉淀 4，沉淀的清洗及干燥 5，RNA质量的评价。

1、取100mg新鲜组织及1ml Trizol放入处理过的匀浆器中匀浆。 2、转移至1.5ml的Eppendorf管中，冰浴10分钟。 3、加入200μl氯仿，充分震荡混匀，静置分层。 4℃，12000rpm离心15分钟。 4、将上清转移至新管，注意不要吸到中间层的蛋白沉淀，加入等体积的异丙醇（4℃预冷）混匀。－20℃放置30min。 5、4℃，12500rpm离心20分钟，弃上清。 6、加入1ml 75％乙醇洗涤一次，小心倒掉乙醇。 7、37℃烘干,加入50μl DEPC处理过H20溶解沉淀，负80℃保存备用。 8、测定A260/A280

实验操作： 1）RNA的电泳分离

cDNA第一链的合成： （2）70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。 然后加入下列试剂的混合物： （1）在0.5ml离心管中，加入总RNA 1.0μg，补充适量的DEPC H2O使总体积达14μl。在管中加10μmol/L Oligo（dT）18μl，轻轻混匀、离心。 （2）70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。 然后加入下列试剂的混合物： 10×Reaction buffer 2μl 10mM dNTPmix 1μl 0.1M DTT 2μl 轻轻混匀，离心。42℃孵育2-5min。 （3）加入逆转录酶1μl ，在42℃水浴中孵育50min。 （4）于70℃加热15min以终止反应。

Happy New year PCR： 取0.2ml PCR管，依次加入下列试剂： 第一链cDNA 1μl 上游引物（10μM） 2μl dNTP(2.5mM) 2μl 10×PCR buffer 2.5μl Taq 酶（2U/μl） 1μl ddH2O 14.5μl 轻轻混匀，离心 Happy New year