第一节 克隆载体 1. 质粒载体（plasimid vectors） 2. 噬菌体载体（phage vectors） 第一节 克隆载体 1. 质粒载体（plasimid vectors） 2. 噬菌体载体（phage vectors） 3. 柯斯质粒载体（cosmid vectors） 4. 人工染色体载体（B/Y/HAC）

噬菌体简介 Bacteriophage(phage) 是比细菌还小得多的微生物，噬菌体侵犯细菌，可以认为它是细菌里的“寄生虫”。 组成：蛋白质、核酸. 结构：蛋白质外壳、尾巴 尾巴上的微丝可以把噬菌体的DNA注入细菌内。

噬菌体或病毒的DNA能被开发成为基因工程的有用载体，因为： 1.高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞； 2.自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增。

大肠杆菌的λ-噬菌体 （一） λ-噬菌体的生物学特性 1、由外壳包装蛋白和λ-DNA组成 2、 λ-DNA的物理图谱 （1）功能相近的基因在基因组中聚集在一起 目前已经被确定的基因至少61种，一半为必需基因

（2）线状双链DNA，两端各有一个12bp的互补单链（粘性末端，cohesive-end site），称λcos site ，粘性末端粘连接变成环状DNA。 其中有一半左右参与了噬菌体生命周期的活动，我们称这类基因为λ噬菌体的必要基因；另一部分基因，当它们被外源基因取代之后，并不影响噬菌体的生命功能，我们称这类基因为λ噬菌体的非必要的基因。 48.5kb

λ噬菌体基因大致分为3个区： 结构区：A～ J19个基因，编码头、 尾部蛋白质 非必须区： 非必须，基因重组int（intagrate）及xis（excision） 功能区：裂解相关S和R，复制相关O和P

3、感染周期（溶菌循环） λDNA复制早期：一个ori ，双向复制 晚期：滚环复制--多个λDNA分子形成线状多联体 吸附于大肠杆菌外膜上的LamB受体(正常功能是运转麦芽糖进入细胞内),麦芽糖可诱导这些受体的合成,故它也可促进λ噬菌体的吸附与感染(尾部吸附). （1）吸附 吸附于大肠杆菌外膜上的LamB受体（正常功能是运转麦芽糖进入细胞内），麦芽糖可诱导这些受体的合成，故它也可促进λ噬菌体的吸附与感染（尾部吸附）。 　　（2）DNA注入 　　（3）DNA复制 从单一ori区滚筒复制，形成线状多联体，λ-DNA上两个基因的产物激活复制的起始，但复制所需的蛋白因子系统则由宿主细胞提供。 　　（4）包装 包装蛋白在宿主细胞内合成，包装蛋白首先结合在cos区的附近，形成包装启动复合物，因此cos区对包装是至关重要的,　包装时由一个蛋白因子将cos区切开，从而保证只有一个DNA 线状负责被保证在一起，每个宿主细胞可包装多达100个成熟的λ-DNA分子，包装对DNA本身的性质无关，但对其大小要求比较严格，它只能包装λ-DNA分子的75%-105%，也就是说可以包装36.4kb-50.9kb范围内的DNA，包装好了的λ-DNA便形成成熟的噬菌体颗粒。 （5）裂解 每个细胞内容纳了多达100个成熟的噬菌体，这时两种负责裂解宿主细胞的蛋白被合成，细菌细胞被裂解，成熟的噬菌体释放出去，又去感染另外的宿主细胞，直至大肠杆菌细胞全部被裂解。 λDNA复制早期：一个ori ，双向复制 晚期：滚环复制--多个λDNA分子形成线状多联体

包装 E 头部包装蛋白首先结合在cos区的附近，形成包装启动复合物，A蛋白切割cos位点。 包装 包装蛋白在宿主细胞内合成，包装蛋白首先结合在cos区的附近，形成包装启动复合物，因此cos区对包装是至关重要的,　包装时由一个蛋白因子将cos区切开，从而保证只有一个DNA 线状负责被保证在一起，每个宿主细胞可包装多达100个成熟的λ-DNA分子，包装对DNA本身的性质无关，但对其大小要求比较严格，它只能包装λ-DNA分子的75%-105%，也就是说可以包装36.4kb-50.9kb范围内的DNA，包装好了的λ-DNA便形成成熟的噬菌体颗粒。 （5）裂解 每个细胞内容纳了多达100个成熟的噬菌体，这时两种负责裂解宿主细胞的蛋白被合成，细菌细胞被裂解，成熟的噬菌体释放出去，又去感染另外的宿主细胞，直至大肠杆菌细胞全部被裂解。 头部包装蛋白首先结合在cos区的附近，形成包装启动复合物，A蛋白切割cos位点。

4、溶源状态的建立 噬菌体感染大肠杆菌后，DNA直接整合到宿主细胞染色体DNA上，并不裂解细胞，这种情况称为溶源状态。 整合主要由cI和int基因的产物所激活，这两个基因的开放 与关闭取决于宿主细胞本身的性质。 cI基因：编码阻遏蛋白，是感染了λ噬菌体的寄主细胞进 入溶源化的必要条件。cI基因失活或缺失的λ噬菌体无法 使寄主细胞发生溶源化效应。 DNA重组技术一般需要噬菌体处于溶源状态。

λ噬菌体DNA的整合与删除： 噬菌体基因组可以整合到大肠杆菌染色体DNA上，成为原噬菌体。 适当条件下，原噬菌体又可以脱离寄主染色体，重新变成独立的复制子，这种过程叫做原噬菌体的删除作用。 超感染免疫性 溶源性细菌，由于含有原噬菌体，故不能再 次被同种噬菌体感染。溶源性细菌所具有的这种 抗御同种噬菌体再感染的特性叫做超感染免疫性。 处于整合状态的噬菌体DNA称为原噬菌体

噬菌体的溶源和裂解 入侵E.coli后，可以按裂解或建立溶原两种生活方式生存和繁殖。 侵犯细菌时，只是DNA侵入，然后利用细菌的酶来复制、转录、翻译。

λ-DNA载体的构建 λ噬菌体的缺陷： 基因组太大（48.5kb）； 酶切点太多，它有5个BamH1位点（G↓GATCC），6个BgⅠ位点（A↓GATCT），5个EcoRⅠ位点（G↓AATTC）。 野生型只能接纳一定长度的DNA。若相当于λ噬菌体的75-105%，那么只能接纳48.5kb×5%=2.425kb的DNA。 重组的λDNA分子难于直接导入宿主细胞—利用体外包装成病毒颗粒，然后通过感染的方法注入DNA。

切去部分非必须的区域； 抹去多余的限制性内切酶切割位点； 插入可供选择的标记基因； 建立体外包装系统。 构建λ噬菌体克隆载体的基本策略： (1)缩短长度：野生型λ-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型λ-DNA的长度，可以提高装载量。其实野生型λ-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。 (2)删除重复的酶切位点：野生型的λ-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不利于重组操作，必须删除至1 - 2个；同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点；除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添酶位点。 (3)加装选择标记：与质粒不同，野生型λ-DNA上缺少合适的选择标记，因此加装选择标记是λ-DNA克隆载体构建的重要内容 λ-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类： 免疫功能类标记 颜色反应类标记 (4)构建琥珀密码子的突变体：琥珀型突变（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突变。 大肠杆菌的某些菌株含有特异性的校正基因，其编码产物校正tRNA能专一性地纠正这一突变。将野生型λ-DNA上D和E两个头部包装蛋白的基因中的CAG密码子突变成UAG。当这种λ-DNA进入一般的大肠杆菌菌株后，不能合成有活性的头部蛋白，也就不能被包装和裂解细菌，这样就可以阻止有害重组体的生物污染及扩散，而基因工程实验中使用的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株。 14

野生型:上限51kb λ-DNA：48.5kb，外源基因2.5kb 1、缩短长度 野生型:上限51kb λ-DNA：48.5kb，外源基因2.5kb λ-DNA上有40-50%的DNA是复制，裂解所不必需的，切除便提高装载量。 根据切除的多少，将λ-DNA分为两大类载体： 左侧区包括使噬菌体DNA成为一个成熟的、有外壳的病毒颗粒所需的全部基因，全长约20kb 右侧区内包含所有的调控因子、与DNA复制及裂解宿主菌有关的基因，这个区域约长12kb。 中间区域约长18kb，这一段DNA可以被外源置换而不会影响噬菌体λ裂解生长的能力。置换型噬菌体λ是使用最广泛的载体。 插入型载体、取代型载体

插入型载体（insertion vector） 必须携带标记基因 该类载体经改造后的长度为37kb，为包装的下限，它本身也能被包装，其允许的插入片段最大为13.9kb（54.9-37kb）。由于该类载体重组与否均可包装，因而为区分重组子与非重组子必须携带标记基因。（0-13.9kb） λgt10，可以携带8kb的DNA分子，插入位于cI基因内的单一的酶切位点EcoRI。插入失活导致裂解循环，从而很容易识别重组子。 λZAPII，含有多聚接头，可以使用六种不同的限制性内切酶插入约10kb的新的DNA分子，通过lacZ’基因的插入失活鉴定重组子，不能形成蓝色的噬菌斑。 经改造后只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点,长度为37kb，为包装的下限，它本身也能被包装，允许插入片段最大为14kb.

取代型载体（substitution vector） 该类载体经改造后的长度约为40kb，但在非必需区域内含有两个相同的酶切口（如EcoRI、HindIII、或saλI），两者间的距离为14kb长，使用时用酶切开，分离去除这个14kb长的DNA片段，然后用外源DNA片段取代之。显而易见，这类载体的容量不仅比插入型载体大，而且有一个下限：40-14kb=26kb包装下限为36.4kb，因此其载装下限为10.4而上限为25.5kb。这类载体实际上已经不再需要标记基因，因为空载的载体DNA只有26kb，不可能被包装，因而无法进入受体细胞中去，当然这类载体的使用较为繁琐，现在商品化了的取代型载体已去除了中间片段 具有成对的克隆位点,空载的载体DNA只26kb，不能被包装，无法进入受体细胞中去,不需要标记基因.

应用： 插入型载体只能承受较小分子量（一般在10kb以内）的外源DNA片段的插入，广泛应用于cDNA及小片段DNA的克隆。 替换型载体可承受较大分子量的外源 DNA片段的插入，所以适用于克隆高等 真核生物的染色体DNA。

2、酶切位点的删除或增加 删除重复的酶切位点:野生型λDNA链上有 5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不利于重 组操作，必须删除至1-2个. 为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还 需要增加一些单一的酶切位点. 采用定点突变技术或甲基化酶处理必需区内的酶识别序列使其失活。

3、灭活某些与裂解周期有关的基因 将无义突变引入噬菌体裂解周期所需的基因， 如将头部包装蛋白基因的CAG突变成UAG。这些 噬菌体只能在具有特异校正基因编码产物的菌株内 繁殖。 当这种λDNA进入一般大肠杆菌菌株后，不能合 成有活性的头部蛋白，也就不能被包装和裂解细 菌，可阻止有害重组体的生物污染及扩散。 珀型突变（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突变。大肠杆菌的某些菌株含有特异性的校正基因，其编码产物校正tRNA能专一性地纠正这一突变。 基因工程实验中使用的受体是具有琥珀型突变体校正功能的菌株。

4、加装选择标记 选择标记主要有两类： 免疫功能类标记 颜色反应类标记 野生型λ-DNA上缺少合适的选择标记，因此加 与质粒不同，

(1)免疫功能失活标记 (cI筛选) 加装选择标记cI基因 cI基因编码一种阻止λ-噬菌体进入溶菌循环的阻遏物。 含有完整标记基因的λ-载体进入受体细胞后，建立溶源状态，细菌生长缓慢，形成混浊斑； 当外源DNA插入到标记基因中， 基因灭活， λ-重组分子便进入 溶菌循环，形成透明斑。 CⅠ基因的功能是促使噬菌体进入溶源化，但在正常情况下，它的噬菌斑是不清楚 的，有点浑浊。这是因为在λ噬菌体感染时，有少数细胞进入溶源化途径，这些细 胞生长在噬菌斑中，就造成了噬菌斑浑浊。由于cⅠ基因的产物——阻遏物的失活， 不会有溶源菌的形成，因此，形成的噬菌斑都是清亮的，很容易将重组体与非重组体区 别开来。cI 阻遏物的名字就是指在该基因中插入一段DNA 后会使噬菌斑的形态变得清 亮(c=clear)。

(2)加装选择标记lacZ（蓝白斑筛选） lacZ基因编码β-半乳 糖苷酶，能催化无色的 X-gal生成蓝色化合物。 基因中，基因灭活，不能 合成蓝色化合物； 而空载体λ-DNA则产 生蓝色透明斑。

5、建立-噬菌体的体外包装系统 体外包装原理： λ噬菌体的头部和尾部的装配是分开进行的。 头部基因发生了突变的噬菌体只能形成尾部和头部蛋白所需的蛋白因子； 尾部基因发生了突变的噬菌体则只能形成头部和 尾部蛋白所需的蛋白因子。 λ-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞 用于体外包装的蛋白质可直接从感染了λ噬菌体的大肠杆菌中提 取，现已商品化。这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分： 一部分缺少E组份，另一部分则缺少D组份。包装时，当且仅当 这两部分包装蛋白与重组λ-DNA分子混合后，包装才能有效进 行，任何一种蛋白包装液被重组λ-DNA污染后，均不能被包装 成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的 将这两种突变型的噬菌体的提取物混合起来，便能够在体外装配成有生物活性的噬菌体颗粒。

λDNA的体外包装作用，在离体条件下，将重组体DNA包入噬菌体等病毒颗粒中的过程，以形成有功能的病毒载体。 sup-不具有琥珀型突变体校正功能的菌株

可在体外包装成噬菌体颗粒，高效转染大肠杆菌 λ-DNA载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒 的装载量重组λ-DNA分子的筛选较为方便 λ-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，常用于 构建基因文库 在克隆载体基础上，为使插入的外源DNA片段有效转录翻译成多肽，装有强化外源基因表达的强启动子以及利于表达产物分泌、分离和纯化的元件，这种载体称为表达载体。 缺点： (1)需要包装比较麻烦，包装率又不稳定，购买包装蛋白的费用又高； (2)没有质粒的用途广泛。