Design and Preparation of Microfluidics 第1章 微流控芯片设计与制备 Design and Preparation of Microfluidics 林金明 清华大学化学系 http://www.linlab-tsinghua-edu.org/ Cell Analysis on Microfluidics （微流控芯片细胞分析）

分离 检测 分析化学 信息结果 样品

分析化学的发展过程 光、电、磁、热、质量等检测技术 细胞时生物体形态结构和生命活动的基本单位，了解细胞的组成、结构和功能，探索细胞的生命活动，研究细胞间相互作用，对于人类认知与掌握生物体的生命活动有着十分重要的意义。 Cells are basic structural and functional units of living organisms. Understanding the composition, structure and function of cells, and exploring cellular activities, are quite important for the cognition of phenomena and rules of life.

细胞分析的难点： 细胞代谢 细胞生理过程 尺寸微小（微米级），难于操纵； 细胞内待测物含量少，需高灵敏度检测； 细胞—生命体最基本的结构和功能单元 细胞相互作用 细胞生理过程 细胞代谢 细胞定量 细胞识别 生命科学研究 疾病诊断、药物筛选等 细胞分析的难点： 尺寸微小（微米级），难于操纵； 细胞内待测物含量少，需高灵敏度检测； 细胞内生物学容量大，需高通量分析。 细胞是生命体最基本的结构与功能单位。研究细胞代谢、信号转导、衰老与凋亡等，对于疾病诊断、药物筛选等具有重要的意义。但是，细胞研究存在许多难点： 1）尺寸微小，难于操控；2）细胞内待测含量少，需要高灵敏的检测；3）细胞内生物学容量大，需要高通量分析。

清华大学林金明教授将研究组长期科研成果以及研究生培养过程中积累的经验，于2017年底在Springer出版《Cell Analysis on Microfluidics》专著，并为清华大学本科生开设“微流控芯片细胞分析”选修课程，得到广泛的欢迎。希望有更多涉及医学、生物学、化学、材料、仪器仪表等领域的研究组参与这一内容的研究，推动细胞分析与技术应用的进展。

1. 背景知识 特点： 微流控芯片： 芯片加工材料具有生物相容性 微米级通道，与细胞尺寸相近 能提供相对封闭的微环境符合细胞 的生长 在一块几平方厘米（甚至更小）的芯片上集成化学和生物等领域中所涉及的样品制备、反应、分离、检测以及细胞培养、分选、裂解等基本操作单元，由微通道形成网络，以可控流体贯穿整个系统，用以取代常规化学或生物实验室的各种功能的一种技术平台。 特点： 芯片加工材料具有生物相容性 微米级通道，与细胞尺寸相近 能提供相对封闭的微环境符合细胞 的生长 所需试剂和样品消耗量非常小 分析速度快 易于实现集成化、自动化、便携化 Whitesides G M. Nature, 2006, 442, 368-373. Quake, S. R. Science, 2005, 309, 137-140.

背景知识 微流控芯片用于细胞研究 3 多功能集成的微流控芯片用于细胞分析 微流控芯片上模拟人工肺的功能 E.-A. Jamil, et al., Nature, 2006, 442, 403-411. D. Huh, et. Al., Science, 2010, 328, 1662-1668 3

2. 微流控芯片的设计与制备 基本原理与应用 玻璃芯片毛细管电泳 高聚物芯片毛细管电泳 毛细作用驱动微流控免疫分析芯片 芯片上测定表面张力 毛细直流技术在芯片通道中的应用 单一颗粒物微流控芯片分析检测体系 通道集成于单PDMS层的立体多层芯片

2.1 微流控芯片基本原理与作用 微流控芯片技术是将待测样品的采集、预处理、分离、检测等功能集成在一个系统中，即“微全分析系统”（micro total analysis system,µ-TAS）。具有多功能、快速、简便、经济等特点。是目前分析化学领域研究热点方向之一。 2cm 4cm

作 用 微流控芯片是一个灵活多样的分析平台，各种样品采集、预处理、分离、检测方法都可以整合在芯片上 芯片材料 硅 玻璃 石英 高聚物等。 作 用 微流控芯片是一个灵活多样的分析平台，各种样品采集、预处理、分离、检测方法都可以整合在芯片上 芯片材料 硅 玻璃 石英 高聚物等。 加工技术 光刻 热压 模塑 键合等。 流体驱动 电泳 微泵 重力 毛细作用等。 分离技术 区带电泳 凝胶电泳 等电聚焦等。 检测技术 荧光 化学发光 电化学 质谱等。 6 应 用 细胞分析 免疫分析 化学合成等。

2.2 玻璃芯片： 通过玻璃键合 2cm 李海芳博士，高工 清华大学分析中心

玻璃芯片通道设计与键合 Cr or Au Etching glass Positive photoresist Etching Cr UV light Developing Photomask Etching Cr Positive photoresist Etching glass Striping Cr & photoresit Bonding 650 0C

玻璃芯片通道显微观察

光源：激光器 光源：发光二极管 光纤导入激光诱导荧光微流控芯片检测系统 LD emitting light: 473 nm 光源：激光器 光源：发光二极管 H.-F. Li, J.-M. Lin, et al., Electrophoresis, 2004, 25, 1907-1915

激光诱导荧光微流控芯片检测系统 光纤通道 Laser Optical fiber Plano-convex lens Computer 林金明，李海芳， 发明专利申请号: 0315608.X，2003-8-29 Computer PMT Filters Pinhole A/D converter

毛细管电泳原理

(fluorescein isothiocyanate, FITC) 灵敏度高 操作简便 重现性好 异硫氰酸荧光素 (fluorescein isothiocyanate, FITC)

玻璃芯片毛细管电泳（化学发光检测） 检测口 苏荣国 博士 中国海洋大学化学化工学院 海洋化学 分离通道 中国发明专利号：02125864.3

弯道的立体效应与设计

Microchannel 芯片键合与组装 Cover plate Middle plate 100 mm Bottom plate

芯片分离与检测系统的研究 HPLC-CL System Chip-CL System 胶束 -) +) -) +) -) +) EOF 1.5 mL/min 20 cm Coil 0.01 M KIO4 IO4- 0.06 M K2CO3 0.1 M KOH 1×10-5 M Luminol IO4- C-18 ODS (4.6f, 25 cm) -) +) IO4- Waste IO4- 50 mL 1.5 mL/min CH3CN:C2H5OCOCH3:0.05%H3PO412:0.6:90(v/v) HPLC-CL System OH- CO32- +) CO32- OH- -) LH- OH- Silicon photodiode Waste Buffer solution 胶束 -) +) EOF Chip-CL System

80 mm 100 mm

儿茶酸的芯片微隧道胶束电色谱分离 Time/min Relative CL intensity 100 8 10 2 5 6 4 3 7 Time/min 8 10 100 Relative CL intensity 茶叶中7种主要儿茶酚（也称：茶多酚）的芯片电泳分离及化学发光检测

聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控芯片的制备流程 2.3 高聚物芯片的合成与制作 博士学位论文答辩 博士学位论文答辩 聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控芯片的制备流程 Creating –SiOH on the inner wall of microchannel Photomask Photoresis layer Cr layer Glass layer 曽湖烈博士 Tokyo Metropolitan University Assistant Professor

通道集成于单PDMS层的立体多层芯片 加工流程 博士学位论文答辩 博士学位论文答辩 Process flow for multilayer fabrication; (A) Wet etching of original glass; (B) imprinting PMMA replica master against the glass master to obtain PMMA replica master and four solid columns and hollow columns were formed as support columns and localizer; (C) casting PDMS against the PMMA replica master and peeling the cured PDMS replica off from the PMMA replica master; (D) Two additional PDMS substrates were sealed on the channel layer, and bonded after oxidized in a plasma discharge. 加工流程

通道集成于单PDMS层的立体多层芯片 PDMS prepolymer Thermal printing 博士学位论文答辩 博士学位论文答辩 PDMS prepolymer Combined PMMA template 3D microdevice Thermal printing

高分子材料合成制作的芯片

环糊精聚丙稀酰胺手性分离芯片制备 合成的功能性 手性选择剂 PDMS通道 表面预处理 丙稀酰胺单体 交联剂 引发剂 手性分离芯片 H.-L. Zeng, H.-F. Li, X. Wang, J.-M. Lin, Talanta, 2006, 69(1), 226-231.

手性异构体在PDMS微芯片PAA凝胶整体柱中分离

键合β－CD的PDMS芯片PAA凝胶整柱电色谱应用 手性异构体的拆分 键合β－CD的PDMS芯片PAA凝胶整柱电色谱应用 Rs=1.63 五种FITC标记的氨基酸的分离谱图 FITC标记的丹酰化苏氨酸手性分离谱图 样品浓度: 50μM 进样条件: T进样 800V 30s 分离条件: 2500V 缓冲液: 0.1MTris0.25M硼酸7M尿素 H.-L. Zeng, H.-F. Li, J.-M. Lin, Anal. Chim. Acta, 2005, 551, 1-8.

2.3 纸材料芯片 Examples of uPADs 2.3 纸材料芯片 Zhang Y, Zhou CB, Nie JF, Le SW, Qin Q, Liu F, Li YP, Li JP. Anal Chem, 86 (4):2005-2012. Hossain SMZ, Brennan JD. Anal Chem, 83 (22):8772-8778. Fenton EM, Mascarenas MR, Lopez GP, Sibbett SS. Acs Appl Mater Inter, 1 (1):124-129. Examples of uPADs

2.4 其他材料 Whitesides group reported PDMS chip fabrication through soft lithography in late 1990s, and ever since soft lithography has been broadly accepted by researchers and become a primary chip preparation method.

其他材料 Applications: cell culture model, drug metabolism, droplet technology Jie M, Li H F, Lin L, et al. RSC Advances, 2016, 6(59): 54564-54572. Chen Q, Chen D, Wu J, et al. Biomicrofluidics, 2016, 10(6): 064115. Kim S, Lee H, Chung M, et al.Lab on a Chip, 2013, 13(8): 1489-1500.

本章总结 1．作为当代科学研究前沿领域之一，微流控芯片的设计、研制以及应用研究方兴未艾，可供创新的机会很多。 2. 这一课程是分析化学可与其他多种学科进行交叉学习和研究的重要切入点，对于培养综合性、高水平研究人才将起到重要作用。 3. 后续的12章内容将进一步修改，并陆续挂到林金明教授实验室网上，欢迎各位下载参考使用。

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