第 六 节 植 物 克 隆 载 体

一、Ti质粒载体 i. 不需要补充植物激素便可进行离体培养 1. 根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)与Ti质粒 G-菌，可侵入90科双子叶植物受伤组织，形成冠瘿瘤(crown gall tumor)。冠瘿瘤细胞具有以下特征： i. 不需要补充植物激素便可进行离体培养 ii.合成肿瘤特有的化合物—冠瘿碱(opine)，能专一 的为根癌农杆菌所利用. 这两个特征由Ti质粒决定，但该质粒中仅有一部分进入植物细胞。

1) Ti 质粒类型（由Ti 质粒所产生的冠瘿碱种类而定） i. 鱆鱼碱类(octopine) ii. 胭脂碱类(nopaline) iii.农碱类(agropine) 2) Ti 质粒的结构 i. 环状ds-DNA,160-250kb，具六个功能区 i) 致瘤区：合成植物生长素和细胞分裂素 ii) 冠瘿碱合成区：参与冠瘿碱合成 iii) 冠瘿碱分解区：参与冠瘿碱分解 iv) Ti 质粒转移区(tra)：参与不同农杆菌中的接合转移 v) 毒（性）区：参与T-DNA的转移和插入植物染色体 vi) DNA复制区：参与Ti 质粒DNA复制

Ti质粒的结构

不同Ti 质粒中的T-DNA结构是不相同的，其中 i) 胭脂碱Ti 质粒的T-DNA长23bp,结构连续，具13个基因 ii. T-DNA T-DNA包括植物激素冠瘿碱合成区基因及两侧相同的25 bp重复序列，T-DNA整合不具特异性，右侧25 bp重复序列对T-DNA的转移至关重要。 不同Ti 质粒中的T-DNA结构是不相同的，其中 i) 胭脂碱Ti 质粒的T-DNA长23bp,结构连续，具13个基因     ii) 鱆鱼碱Ti 质粒中的T-DNA不连续，分左右两段，分别称之为TL和TR, TLDNA长13.2 kb,含8个基因，包括鱆鱼碱合成酶和植物激素合成基因, TR –DNA长7.9 kb，含5个基因，参与甘露碱(mannopine)和农碱合成 iii)两者同源性：主要集中在植物激素合成区。

Ti质粒的T-DNA的同源性

2. Ti质粒载体 ii)T-DNA的存在不能使转化细胞再生为完整植株 由以下几部分组成： 2) 载体类型 i)中间载体(intermediate vector) 由以下几部分组成： 适合于E.coli和A.tumefaciens自主复制和选择用标记基因 适合于植物细胞选择用标记基因 一段来自天然Ti质粒的部分T-DNA序列（提供同源重组） 1-2个来自T-DNA的25bp重复序列 用于表达外源基因的DNA序列（如启动子、终止子序列）

中间载体或重组子 E.coli(中宿主) A.tumefaciens 重组DNA的转移过程： 中间载体或重组子 E.coli(中宿主) A.tumefaciens   在根癌农杆菌中与天然Ti质粒或非致瘤质粒发生共整合作用 感染植物受伤组织或与植物细胞共培养 T-DNA进入植物细胞并整合到染色体DNA中 外源基因表达 转化 接合 转移

根癌农杆菌中Ti质粒的转移

Ti载体的共整合作用

Ti质粒衍生的植物克隆载体

非致瘤载体的重组

ii)非致瘤Ti质粒载体(disarmed Ti plasmid) 该类载体实际上是辅助载体，其特点是用pBR322 DNA取代了Ti质粒中参与植物激素合成基因序列，它可以与含有pBR322 序列的DNA发生同源重组，构成一个完整的重组DNA序列，然后转移至植物细胞。 如果在中间载体中插入一个T-DNA的25bp重复序列，在非致瘤Ti质粒载体中插入另一个25bp重复序列，经重组后形成一个完整的T-DNA，这种系统称之为分离末端载体系统(SEV,Split End Vector)。 iii)双末端载体(binary vector) 该类载体的显著特点是含有两个T-DNA末端，所有需要转移到植物细胞中去的序列都位于其间。

分离末端载体的共整合作用(SEV)

T-DNA的转移必须依赖于辅助质粒，pAL4404就是一个T-DNA全部丢失的天然缺失突变体。转移过程： 例子: pBIN19的结构 T-DNA的转移必须依赖于辅助质粒，pAL4404就是一个T-DNA全部丢失的天然缺失突变体。转移过程： pBIN19 E.coli A.tumefaciens T-DNA进入植物细胞 该系统的最终转化频率比SEV系统高得多 3）标记基因 生化标记基因：冠瘿碱合成酶基因（NOS，OCS）lacZ, CAT, 荧光酶基因，GUS 药物抗性标记基因：除草剂耐受性基因，CHMTⅡ（金属巯蛋白基因），Bleomycin，Hgyr，SPT, DHFR, NPTⅡ (Kanr, G418r) 标记基因常用的启动子有CaMV 35S,OCS,NOS等。 转化 接合 转移

植物的双元载体pBIN19

二、病毒载体 2. RNA病毒载体 2) 双生病毒：2.5-3kb,环状ss-DNA，可感染单子叶植物，短暂表达。 1）转化频率高; 1）CaMV ：8kb，环状ds-DNA，8个ORF，致死，最多可容纳800bp外源DNA，只能用语作短暂表达(transient expression) 2) 双生病毒：2.5-3kb,环状ss-DNA，可感染单子叶植物，短暂表达。 2. RNA病毒载体 BMV（雀麦花叶病毒）和TMV载体优点： 1）转化频率高; 2）宿主范围广; 3）高拷贝，外源基因高效表达。

第 七 节 动物分子克隆载体

一. 构建动物克隆载体的病毒种类和特征 病毒类型 例子 病毒大小(nm) 基因组结构 基因组大小(kb) 细小病毒   病毒类型 例子 病毒大小(nm) 基因组结构 基因组大小(kb) 细小病毒 野生型 H-1,RV,MVM 20 ss-DNA 1.8-2.7 缺陷型 AAV 乳多空病毒 乳实瘤 兔,人(BPV) 30-50 环状ds-DNA 4.5-7.5 多型瘤 小鼠肿瘤 空泡 SV40，BKV 腺病毒 人(AD) 80-90 ds-DNA 30-40 疱疹病毒 HSV,EBV 100-150 ds-DNA 80-140 痘病毒 300×200×100 ds-DNA 240-300 逆病毒 MLV,MSV 100-120 ss-RNA 8.5

二. 病毒型载体 2. 载体种类 2) DNA转移效率高，但必须与天然(辅助)病毒共感染动物细胞 1. 特点 1) 可在动物细胞中形成病毒颗粒（形态构成组分来自天然病毒或原病毒细胞） 2) DNA转移效率高，但必须与天然(辅助)病毒共感染动物细胞        3) 大多数被感染动物细胞将是致死的，但有少数病毒（如逆病毒）载体可稳定整合到染色体DNA中。        4) 插入病毒载体的外源基因只能在动物细胞中作瞬时表达 2. 载体种类 根据构建载体的病毒基因大小可分为两类：

1）复制型：由小分子病毒DNA 构建而成，具复制起点，其克隆位点可在病毒DNA之内，亦可在病毒DNA之外，这类载体有的容量十分有限（如SV40），有的则很大（如HSV），其容量大小主要取决于病毒外壳蛋白的包装能力。 2）非复制型：这类载体是在细菌克隆载体中插入一段病毒DNA（不含复制起点）。当外源DNA插入该载体后，与相应的天然病毒一起感染动物细胞，外源DNA可借助两病毒DNA同源部分的重组插入天然病毒。这类载体特别适合于那些较大的病毒DNA分子。 实例：痘病毒长180kb,编码150多种多肽，整个生存阶段均在细胞质内，它能合成DNA复制、转录和转录后修饰的各种酶类，由此病毒构建的非复制型载体就是在细菌载体中插入一段痘病毒DNA.

三. 质粒型载体 1. 特点：不能形成病毒颗粒，以高拷贝质粒形式存在于动物细胞内，不导致动物细胞死亡。 2. 组成：pMB1和病毒复制起点（如SV40，BPV，EBV等），适合于细菌和动物细胞的选择标记基因。 3. 实例 1)  SV40质粒载体 SV40具如下物理图谱，5243bp, 为两种抗原（T-和t-抗原）和三种病毒衣壳蛋白编码。其中T-抗原参与SV40的有效感染，并能特异地结合在病毒DNA复制起点上，这种结合对DNA复制是必须的。因复制起点与该基因的启动子顺序相近，故它本身的表达也受到T-抗原的控制。 当含SV40复制起点的质粒型载体或重组DNA分子转入COS细胞后(含有SV40的T-抗原)可大量复制, 其拷贝数可达20-40万。

SV40质粒载体

2)  BPV-1质粒载体 BPV-1中69T是转化动物细胞所必需的, 约占该病毒DNA总长的69%, 单向转录。由69T和E.coli质粒载体构成穿梭质粒载体。 BPV质粒载体

三. 整合型载体 这类载体可借助同源重组作用使外源基因插入染色体或病毒基因组中。 1. 逆病毒克隆载体 1) 逆病毒用于载体的优点: 三.  整合型载体 这类载体可借助同源重组作用使外源基因插入染色体或病毒基因组中。 1. 逆病毒克隆载体 1) 逆病毒用于载体的优点: i.  基因组小, 易于操作 ii. 高滴度, 易于导入细胞 iii. 准确整合入受体细胞染色体中, 外源基因可稳定表达，具有强转录增强子, 可在多种细胞中高效表达外源基因

iv. 导入生殖细胞或胚胎干细胞, 产生转基因动物 v. 用作插入突变剂 vi. 用于逆病毒分子生物学研究 2) 逆病毒载体的用途 i.   基因治疗 ii.  在胚胎组织中研究特定基因的发育功能 iii. 可用作家系标记 iv. 导入生殖细胞或胚胎干细胞, 产生转基因动物 v.  用作插入突变剂 vi. 用于逆病毒分子生物学研究 3) 逆病毒的生活史和基因组结构 生活史: 病毒粒子感染 反转录为线状ds-DNA 整合到染色体中转录为2个mRNA分子 翻译成病毒蛋白 包装成病毒粒子 释放到细胞外

4) 逆病毒的宿主范围 结构: i. 长末端重复(long terminal repeat, LTR) ii.  正链和反链引物序列PB(-), PB(+) iii. 包装序列Ψ(gag基因编码区5’-端420 bp序列) iv. 反式作用基因: gag—核心蛋白; pol—反转录酶/整合酶; env-外壳糖蛋白 v.  RNA剪接供体和受体序列SD, SA 4) 逆病毒的宿主范围 i.  种特异性---窄谱(ecotrophic): 如M-MLV仅限于鼠细胞；广谱(amphotropic): 如MLV在鸟和哺乳动物细胞, 用M-MLV所构建的载体也可具广谱性, 只要用广谱逆病毒的外壳蛋白包装即可 ii.  组织特异性---成纤维细胞, 淋巴细胞, 上皮细胞 iii. 免疫性

2. 痘病毒克隆载体 5) 逆病毒克隆载体 仅保留逆病毒的LTR序列, 无标记基因 i.  单基因载体 仅保留逆病毒的LTR序列, 无标记基因 ii. 双基因载体: 剪接载体; 内启动子载体; 双顺反子载体。 在剪接载体中, 逆病毒的LTR序列和剪接位点保留, 两基因共用一个启动子和翻译起始区; 在双顺反子载体中, 两基因共用一个基因启动子, 但有各自的翻译起始区; 在内启动子载体中, 两基因各有自己的启动子 iii. 自失活载体(self-inactivation vector) iv. 自主复制载体(replication-competent vector) 2. 痘病毒克隆载体 将痘病毒的部分DNA插入细菌载体中, 借助同源序列的重组作用整合到病毒基因组中

逆病毒的结构和载体结构

3. 昆虫核型多角体病毒载体 该类病毒载体是病毒整合型表达载体，具有以下优点： 1）外源基因可获得高表达：1-500mg/L 培养物 2）表达产物仍具有生物学活性 3）重组效率高

昆虫杆状病毒表达系统

昆虫杆状病毒的 转移载体和表达载体

三.  标记基因 1.  tk基因和dhfr基因(胸苷激酶和二氢叶酸还原酶基因) 需相应的突变体 2.  gpt基因（来自E.coli） 非转化细胞可生长在加有氨基喋呤和霉酚酸，腺嘌呤的培养基中。若培养基中不加入鸟嘌呤而改用黄嘌呤则此细胞不能生长，但转化性细胞则能在此培养基中生长。

3.药物抗性基因 Tn 5的氨基糖―3’-磷酸转移酶基因可抗neomycin， Kanamycin，G418（抑制真核细胞的蛋白质合成）, 潮霉素抗性基因等。