实验 细菌的染色 细菌的单染色法 细菌的革兰氏染色 芽孢染色 荚膜的染色

实验目的 1、学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色法。 2、初步认识细菌的形态特征。 3、学习细菌的革兰氏染色原理和方法 4 、了解细菌的特殊形态结构： 芽孢、荚膜的染色 5、学习训练无菌操作技术。

1 细菌的简单染色 实验原理 细菌细胞微小，透明，不易观察，需染上颜色。  简单染色是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。  常用碱性染料进行简单染色，因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色，经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。

常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。  当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。

实验材料 1、菌种 枯草芽孢杆菌12～18h培养物 金黄色葡萄球菌24h培养物 2、染色剂 吕氏碱性美蓝染液 齐氏石碳酸复红染液

四、实验步骤 操作步骤 无菌操作 涂片 水洗 干燥 干燥 固定 染色 镜检

1、涂片 如用菌悬液或液体培养物，可用接种环挑取1-2环直接涂于载玻片上。 操作步骤（continued） 1、涂片 取两块载玻片，各滴一小滴（或用接种环沾取）生理盐水（或无菌水）于玻片中央，用接种环以无菌操作从枯草杆菌（1d）斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混合并涂成薄膜。 如用菌悬液或液体培养物，可用接种环挑取1-2环直接涂于载玻片上。 Notes: 1） 载玻片要洁净无油迹 2）滴生理盐水和取菌不宜过多 3）涂片要涂抹均匀，不宜过厚。

操作步骤（continued） 菌悬液 涂片 干燥 固定 滴加无菌水 取菌苔 涂片

注意：温度不宜过高，以玻片背面不烫手为宜， 否则会改变甚至破坏细胞形态 操作步骤（continued） 2、干燥 室温自然干燥 3、固定 固定的目的： 1）使细胞质凝固，以固定细胞形态； 2）并使菌体牢固地附着在载玻片上。 固定方法： 热固定：涂面朝上，通过火焰数次 注意：温度不宜过高，以玻片背面不烫手为宜， 否则会改变甚至破坏细胞形态

操作步骤（continued） 4、染色 ◇ 将玻片平放于玻片搁架上，滴加染液于涂片上（染液刚好覆盖涂片薄膜为宜）。 ◇ 美蓝染色1-2min；石碳酸复红染色约1min。 5、水洗 倒去染液，用洗瓶（内装自来水）轻轻冲洗，直至涂片上流下来的水无色为止；染色废液收集在废液缸中。 Note: 水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端流下，水流不宜过急，以免涂片薄膜脱落。

操作步骤（continued） 6、干燥 自然干燥或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干。 7、镜检 细菌个体微小，一般使用油镜观察细菌个体形态。

油镜使用完毕，切记按规定步骤擦干净，否则可能损害镜头 操作步骤（continued） 7、镜检（continued） Notes: 必须等涂片完全干后才可滴加香柏油 油镜使用完毕，切记按规定步骤擦干净，否则可能损害镜头 3）擦油镜镜头方法：分三步 A）先用擦镜纸揩去镜头上的香柏油 B）从双层瓶的下层沾少许二甲苯滴在另一片擦镜纸上 ，擦拭镜头； C）再用一小片擦镜纸擦去镜头上可能残留的二甲苯。

2、革兰氏染色 单染色法：只能观察微生物的大小、形状、和细胞排列状况，但不能鉴别微生物以及它的特殊构造等。 复染色法：用两种或两种以上染色液进行染色，有协助鉴别微生物的作用，故也称鉴别染色法。常用的有： 革兰氏染色法、抗酸染色法、芽孢染色法、荚膜染色法等。

革兰氏染色（Gram stain） 1984年，丹麦医生Gram采用革兰氏染色法细菌细胞壁区分为两种类型：革兰氏阴性（G+）和革兰氏阳性（G-） 革兰氏染色步骤: 1）结晶紫初染；2）碘液媒染； 3）酒精脱色； 4）番红复染

实验原理 Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，番红复染后呈红色。 G﹢菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性屏障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。

细菌的特殊形态结构 芽孢：休眠体，不利环境下产生，耐受各种极端环境。 荚膜：多糖，包裹在菌体外围，保护菌体

实验材料 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌（2d）、胶质芽胞杆菌 革兰氏染色液一套

实验步骤 革兰氏染色 枯草杆菌的芽孢染色 荚膜的染色 绘图、写实验报告

革兰氏染色的步骤 1. 涂片 2. 初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。 3. 媒染：先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。 4. 脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约15－20秒，后立即用流水冲洗。 5. 复染：滴加番红染色液，染3分钟，水洗后用吸水纸吸干。 6. 镜检：观察染色结果并绘图。

Figure 2 - Gram stain of Gram – E. coli cells Figure 1 - A Gram stain of Gram + Staphylococcus cells.

3 枯草杆菌芽孢的染色 1、制备菌液：加2-4滴蒸馏水于小试管中，用接种环从斜面挑取菌体4环于试管中充分混匀。 2、加染色液：加孔雀绿3滴于1.5ml 离心管中。 3、加热：沸水浴，15-20分钟。 4、涂片：用接种环从离心管中取一环菌涂于一干净载玻片上，制成涂片。 5、干燥、火焰固定 6、水洗：用水洗至流出的水中无绿色为止。 7、复染：加复红染色1-2分钟。水洗，吸水纸吸干。 ８、镜检：10x ，40x 、100X（油镜）观察。

4细菌荚膜的染色 负染色法： 1、制片：取洁净的载玻片一块，加一滴黑墨水，取少量的菌体放入墨水滴中混匀并涂片。 2、刮片：另取一载玻片，以三十度角将其边缘浸入黑素中向右端拖动，将黑素涂成一薄层。 3、镜检：10x ，40x 物镜观察（注意物镜不要接触黑素，不要用油镜观察） 荚膜

本实验安排 每人 简单染色：枯草芽孢（1d）。 革兰氏染色：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、本人斜面菌株。 荚膜染色：胶质芽孢杆菌。

思考题 简单染色: (1) 你认为制备细菌染色标本时，尤其应该注意哪些环节? (2) 如果你的涂片未经热固定，将会出现什么问题？如果加热温度过高、时间太长，又会怎样呢？ 革兰氏染色: (1) 你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性?其中最关键的环节是什么? (2) 现有一株细菌宽度明显大于大肠杆茵的粗壮杆菌，请你鉴定其革兰氏染色反应。你怎样运用大扬杆菌和金黄色葡萄球菌为对照菌株进行涂片染色，以证明你的染色结果正确性。 (3) 进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题？

思考题 荚膜染色法: (1) 通过荚膜染色法染色后，为什么被包在荚膜里面的菌体着色而荚膜不着色？ 芽孢染色法: (1) 说明芽孢染色法的原理。用简单染色法能否观察到细菌的芽孢?

思考题 芽孢染色法 (2) 若涂片中观察到的只是大量游离芽孢，很少看到芽孢囊及营养细胞，你认为这是什么原因？ (1) 说明芽孢染色法的原理。用简单染色法能否观察到细菌的芽孢? (2) 若涂片中观察到的只是大量游离芽孢，很少看到芽孢囊及营养细胞，你认为这是什么原因？

本次实验课结束 请确保油镜头擦拭干净！ 下次实验再见！ 本次实验课结束 请确保油镜头擦拭干净！ 下次实验再见！