确定内部启动子的实验

原核生物rRNA基因 ◆原核与真核生物的rRNA基因在组织结构上的差异: ●重复频率：如E.coli，只重复了7次； ●细菌的16S rRNA 、23S rRNA 、5S rRNA基因组成一个转录单位，在染色体上的排列顺序是∶16S-23S-5S。

原核生物rRNA前体的加工

6.2.2 核糖体的装配 原核生物核糖体的装配 ◆小亚基的rRNA和蛋白质的装配关系:

核糖体RNA的位置关系

核糖体在组装过程中,某些蛋白质必须首先结合到rRNA上,其他蛋白才能组长上去即表现出先后层次。根据同rRNA结合的顺序,将核糖体蛋白分为两种:

◆初级结合蛋白(primary binding protein) 这些蛋白质直接同rRNA结合, 其中同16S rRNA结合的初级蛋白有14种: S3, S4, S17, S20, S6, S15, S8, S18, S9, S11, S12, S13, S7, S1。 同5S rRNA结合的有11种。 ◆次级结合蛋白(secondary binding protein) 这些蛋白质不直接同rRNA结合, 而是同初级结合蛋结合:S10, S16, S2, S6, S21, S14, S19。

核糖体蛋白空间定位

? 真核生物核糖体装配模型 ◆80S前体颗粒形成 ●45S rRNA+5S rRNA+蛋白质 ●45S rRNA 41S rRNA ◆大小亚基前体形成: ●大:32S rRNA和5S rRNA ●小:20S的前体rRNA； ◆小亚基成熟与运送: 20S rRNA18S rRNA ◆大亚基成熟与运送 32S rRNA28S rRNA+5.8S rRNA

核糖体的合成与装配

6.3 核糖体的功能 ? ◆核糖体的RNA结合位点 ◆与mRNA结合的位点:SD序列 ◆蛋白质合成中各位点的协同性 ◆多聚核糖体(polysome) ◆蛋白质合成的抑制剂 ◆蛋白质合成的基本过程 ◆蛋白质寿命

核糖体的功能位点 ?

真核与原核mRNA的差异

SD(Shine-Delgarno) sequence

蛋白质合成中各位点的协同性

多聚核糖体 ?

嘌呤霉素对蛋白质合成的抑制作用

嘌呤霉素对蛋白质合成的抑制作用

6.4 Ribozyme and Antisense RNA ◆反义RNA(Antisense RNA)

6.4.1 真核细胞中的 小分子RNA(small RNA) ◆大小:100～300 bases ◆由RNA聚合酶Ⅱ或RNA聚合酶Ⅲ所合成 ◆某些像mRNA一样可被加帽 ◆类别:scRNA snRNA

scRNA(small cytoplasmic RNA): snRNA(small nuclear RNA)： ◆snRNPs(small nuclear ribonucleoproteins)颗粒； ●一个snRNA, ～10个蛋白质; ●有些蛋白质是某一snRNP所特有，有些则是各种snRNP所共有； ◆ snRNPs分类: 由于snRNA富含脲嘧啶核苷，分类时把它分为U1、U2、……等。

6.4.2 Antisense RNA 反义RNA分类 ◆I类∶ 直接作用于其靶mRNA的SD序列和/或编码区; ◆Ⅱ类: 与mRNA的SD序列的上游非编码区结合,从而抑制靶mRNA的翻译； ◆III类: 核酶(ribozyme)

6.4.3 Ribozyme ◆An enzyme in which RNA rather than protein is responsible for catalytic activity. ◆与蛋白质酶相比，核酶的催化效率较低，是一种较为原始的催化酶。

核酶的作用

核酶的发现 ◆几个基本概念 ●间隔序列(space sequence) ●内含子(intron) ●外显子(exon)

卵清蛋白前体mRNA的加工

◆发现 ◆证明 ●1980s ●Thomas Cech等 ●研究四膜虫的26SrRNA前体加工 ●发现:26S rRNA前体可进行自剪切 (self- splicing) ◆证明 ●26SrRNA基因克隆 ●无细胞系统中转录 ●研究26S rRNA的前体分子剪切

rRNA前体的自剪接

50S核糖体中23S rRNA核酶活性 ◆起因:肽酰转移酶(peptidyl transferase) ◆发现者: Harry Noller等,1992年 ◆实验过程: ●破坏50S亚基核糖体蛋白质 蛋白酶K、SDS、苯酚等 ●破坏rRNA 核酸酶处理50S亚基核糖体 ●抑制蛋白质合成 用抑制剂处理 ◆结论: 具有肽酰转移酶的活性分子是23SrRNA。

6.4.3 核酶 核酶的类型 ◆RNA和蛋白质复合物 核糖核酸酶 P (ribonuclease P),是一种核糖核蛋白, 含有一个tRNA分子(长为375个核苷)和一个分子量为20kDa的多肽。 ◆具有催化活性的小分子RNA ◆Ⅰ、Ⅱ型内含子

Splicing Mechanisms ●Nuclear splicing ●Group I intron splicing ●Group II intron splicing

RNA剪接的三种途径 ?

◆核剪接(nuclear splicing) ●即从pre-mRNA中切除内含子 ●剪接发生在细胞核中 ●加工成熟的mRNA被运送到细胞 质。

mRNA合成、加工与运输

真核生物mRNA的输出

◆Nuclear splicing Mechanisms ●GU-AG rule； ●Spliceosomes : Composed of proteins and RNAs. The RNA components of the spliceosome are five types of small nuclear RNAs (snRNAs) called U1, U2, U4, U5, and U6. ●Lariat-like structure 。

核剪接

GU-AG rule

◆Group I intron splicing ●结构特点: 内含子转录后可以形成9个由碱基 配对形成的特定二级结构, 分别命 名为P1至P9, P1和P7是保守的。 ●需要游离的鸟苷 ●存在的细胞器:核、线粒体、叶绿体 ●基因:前体rRNA、mRNA和tRNA

◆Group I intron splicing

◆Group II intron splicing ●结构特点: 内含子转录后可以形成6个发夹环 ●GU-AG规则 ●不需snRNA参与,不形成剪接体 ●形成套索 ●存在的细胞器:线粒体、叶绿体 ●基因:前体mRNA

II组内含子的剪接

◆榔头型核酶(hammerhead ribozyme) 核酶与基因治疗 ◆榔头型核酶(hammerhead ribozyme) ●是植物病毒中的一种核酶 ●催化时形成一种特殊的二级结构，类似榔头 ●有一个双链螺旋的柄结构(柄II) ●核酶同靶RNA配对形成柄Ⅰ和柄Ⅲ ●切点在靶RNA的柄Ⅰ、柄Ⅱ配对区之间

榔头型核酶

RNA editing ◆RNA editing refers to RNA processing events (other than splicing) that alter the protein-coding sequences of some mRNAs. ◆This unexpected form of RNA processing was first discovered in mitochondrial mRNAs of trypanosomes(锥虫), in which U residues are added and deleted at multiple sites along the molecule. ◆More recently, editing has also been described in mitochondrial mRNAs of other organisms, chloroplast mRNAs of higher plants, and nuclear mRNAs of some mammalian genes.

◆Editing in mammalian nuclear mRNAs, as well as in mitochondrial and chloroplast RNAs of higher plants, involves single base changes as a result of base modification reactions; ◆RNA editing reactions include the deamination of cytosine to uridine and of adenosine to inosine(次黄苷); ◆Apo-B48(2152 amino acids) is synthesized in the intestine as a result of translation of an edited mRNA in which a C has been changed to a U by deamination.

Apolipoprotein B RNA编辑

◆机制: ●引导RNA(guide RNA, gRNAs) ●gRNAs的结构: ●编辑体(editosome) ●U的供体

指导RNA的作用