菌（毒）种及样本采集和保藏 病原微生物实验室生物安全培训 贵州医科大学微生物学教研室 陈峥宏 chenzhenghong@gmc.edu.cn

第一节 菌（毒）种的保藏 一.菌种保藏的意义

二.菌种保藏的原理和目的 根据微生物的生理生化特征，人为地创造条件，使微生物处于代谢不活泼、生长繁殖受到抑制的休眠状态，以减少菌种的变异。一般可以通过降低培养基营养成分、低温、干糙和缺氧等方法，达到防止突变、保持纯种的目的。

标准菌株：由国内或国际菌种保藏机构保藏的，遗传学特性得到确认和保证并可追溯的菌株。 标准储备菌株：由标准菌株经一次传代得到的培养物。 商业派生菌株：由供应商提供的所有特性与标准菌株等效的菌株。 工作菌株：由标准储备菌株经传代得到的培养物。

三、菌（毒）种保藏机构

能够引起人类或者动物非常严重疾病的微生物，以及我国尚未发现或者已经宣布消灭的微生物。 《病原微生物实验室生物安全管理条例》 第一类 能够引起人类或者动物非常严重疾病的微生物，以及我国尚未发现或者已经宣布消灭的微生物。 第二类 能够引起人类或者动物严重疾病，比较容易直接或者间接在人与人、动物与人、动物与动物间传播的微生物。　 第三类 能够引起人类或者动物疾病，但一般情况下对人、动物或者环境不构成严重危害，传播风险有限，实验室感染后很少引起严重疾病，并且具备有效治疗和预防措施的微生物。 第四类 在通常情况下不会引起人类或者动物疾病的微生物。 高致病性病原微生物（毒）种或样本是指在《人间传染的病原微生物名录》中规定的第一类、第二类病原微生物菌（毒）种或样本。

国外菌种保藏机构 1.ATCC(American Type Culture Collection） 2.NBRC (NITE Biological Resource Center)日本技术评价研究所生物资源中心 NBRC（IFO）是由日本经济部、商业部、工业部支持的半政府性质菌种保藏中心。 3.NRRL (Agricultural Research Service Culture Collection) 美国农业研究菌种保藏中心 4.CBS (Centraalbureauvoor Schimmelcultures) 荷兰微生物菌种保藏中心 1.ATCC(American Type Culture Collection）美国典型菌种保藏中心 ATCC 主要从事农业、遗传学、应用微生物、免疫学、细胞生物学、工业微生物学、菌种保藏方法、医学微生物学、分子生物学、植物病理学、普通微生物学、分类学、食品科学等的研究。 该中心保藏有藻类111株，细菌和抗生素16865株，细胞和杂合细胞4300株，丝状真菌和酵母46000株，植物组织79株，种子600株，原生动物1800株，动物病毒、衣原体和病原体2189株，植物病毒1563种。 另外，该中心还提供菌种的分离、鉴定及保藏服务。该中心保藏的菌种可出售。 2.NBRC (NITE Biological Resource Center)日本技术评价研究所生物资源中心 NBRC（IFO）是由日本经济部、商业部、工业部支持的半政府性质菌种保藏中心。主要从事农业、应用微生物、菌种保藏方法、环境保护、工业微生物、普通微生物、分子生物学等的研究。 该中心保藏有细菌1446株，真菌568株，酵母164株。这些菌种主要来自本国的其它菌种保藏中心。该中心保藏的菌种可出售。 3.NRRL (Agricultural Research Service Culture Collection) 美国农业研究菌种保藏中心 NRRL是由美国农业部农业研究中心支持的政府性质的菌种保藏中心。主要从事农业、应用微生物、基因工程、工业微生物、菌种保藏方法、环境保护、分子生物学、食品安全、普通微生物、分类学的研究。 该中心保藏有细菌10500株，真菌45000株，酵母14500株，放线菌9500株。 另外，该中心还提供细菌、真菌、酵母的鉴定服务。 4.CBS (Centraalbureauvoor Schimmelcultures) 荷兰微生物菌种保藏中心 CBS是半政府性质的主要保藏真菌、酵母菌种保藏中心。 该中心主要从事菌种保藏方法、分类学、分子生物学、医学微生物学等的研究。 该中心保藏有真菌35000株、酵母5500株。该中心保藏的菌种可出售。 5.KCTC (Korean Collection for Type Cultures) 韩国典型菌种保藏中心 KCTC是由政府科学技术部门支持的半政府性质的菌种保藏中心。主要从事应用微生物、基因工程、工业微生物、菌种保藏、发酵、分子生物学、分类学等的研究。 该中心保藏有细菌5005株，真菌178株，酵母225株，质粒51株，动物细胞98株，动物杂合细胞21株，植物细胞31株。该中心保藏的菌种可出售。 6.DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen ) 德国微生物菌种保藏中心 DSMZ成立于1969年，是德国的国家菌种保藏中心。该中心一直致力于细菌、真菌、质粒、抗菌素、人体和动物细胞、植物病毒等的分类、鉴定和保藏工作。 该中心是欧洲规模最大的生物资源中心，保藏有细菌9400株，真菌2400株，酵母500株，质粒300株，动物细胞500株，植物细胞500株，植物病毒600株，细菌病毒90株等。该中心保藏的菌种可出售。 另外，该中心还提供菌种的分离、鉴定保藏服务。 7.UKNCC (The United Kingdom National Culture Collection ) 英国国家菌种保藏中心 UKNCC是英国国家菌种的保藏中心。 该中心提供菌种和细胞服务，保藏的菌种包括：放线菌、藻类、动物细胞、细菌、丝状真菌、原生动物、支原体和酵母。该中心保藏的菌种可出售。 8.NCIMB (National Collections of Industrial, Food and Marine Bacterial) 英国食品工业与海洋细菌菌种保藏中心 NCIMB主要从事分类学、分子生物学的研究和采用冷冻干燥方法保藏菌种。 该保藏中心保藏有细菌8500株，抗菌素70株。另外该中心提供如下服务：细菌、抗生素、质粒的分离；细菌（非致病细菌）的鉴定；保藏细菌、酵母、质粒等。 该中心保藏的菌种可出售。 9.BCRC (Bioresources Collection and Research Center)台湾生物资源保存及研究中心（食品工业发展研究所）　 BCRC主要从事农业、应用微生物、细胞生物技术、基因工程、菌种保藏方法、工业微生物、食品科学、发酵、分子生物学等方面的研究。 该保藏中心保存有细菌4541株，真菌3069株，酵母1564株， 质粒451株，动物细胞356株，植物细胞20株，细菌病毒180株，重组DNA宿主217株。菌种保藏方法主要采用冷冻干燥保藏、冷冻保藏、液氮保藏、移接保藏、硅胶保藏等。 该中心保藏的菌种可出售。

国内菌种保藏机构 ACCC 中国农业微生物菌种保藏管理中心 CACC 抗菌素菌种保藏管理中心 CGMCC 普通微生物菌种保藏管理中心 AS 中国科学院微生物研究所 AS-IV 中国科学院武汉病毒研究所 CMCC 医学微生物菌种保藏管理中心 ID 中国医学科学院皮肤病研究所 NICPB 卫生部药品生物制品监察所 IV 中国医学科学院病毒研究所 CVCC 兽医微生物菌种保藏管理中心 CIVBP 中国兽医药品监察所 ACCC 中国农业微生物菌种保藏管理中心 ISF 中国农业科学院土壤肥料研究所 SH 上海市农业科学院食用菌研究所 CACC 抗菌素菌种保藏管理中心 IA 中国医学科学院抗菌素研究所 SIA 四川抗菌素工业研究所 CGMCC 普通微生物菌种保藏管理中心 AS 中国科学院微生物研究所 AS-IV 中国科学院武汉病毒研究所 CFCC 林业微生物菌种保藏管理中心 CAF 中国林业科学院菌种保藏管理中心 CICC 工业微生物菌种保藏管理中心 IFFI 轻工业部食品发酵工业科学研究所 CMCC 医学微生物菌种保藏管理中心 ID 中国医学科学院皮肤病研究所 NICPB 卫生部药品生物制品监察所 IV 中国医学科学院病毒研究所 CVCC 兽医微生物菌种保藏管理中心 CIVBP 中国兽医药品监察所 YM 云南省微生物研究所 GIMCC 广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心 CCTCC 中国典型培养物保藏中心 ，武汉大学 CCDM 华中农业大学菌种保藏中心， 华中农业大学 CMBGCAS 海洋微生物中心 HKUCC 香港大学保藏中心，香港大学 CUHK 香港中文大学保藏中心，香港中文大学 BCRC 台湾生物资源保藏研究中心，台湾新竹

中国医学菌种保藏中心提供的标准菌株

美国国家菌种保藏中心提供的标准菌株

法国生物梅里埃公司提供的商业派生菌株（Bioball)

四、菌（毒）种保藏方法

低温保藏法 冰箱或超 低温冰箱

磁珠菌种管保藏

菌种保藏的注意事项 菌种在保藏前所处的状态 菌种保藏所用的基质 操作过程对细胞结构的损害

菌（毒）种及感染性样本的管理 1. 实验室菌（毒）种及感染性样本保存、使用管理，应依据国家生物安全的有关法规，制定选择、购买、采集、包装、运输、转运、接收、查验、使用、处置和保藏的政策和程序。 2. 实验室应有2名工作人员负责菌（毒）种及感染性样本的管理。 3.实验室应具备菌（毒）种及感染性样本适宜的保存区域和设备。

4.保存区域应有消防、防盗、监控、报警、通风和温湿度监测与控制等设施；保存设备应有防盗和温度监测与控制措施。高致病性病原微生物菌（毒）种及感染性样本的保存应实行双人双锁。 5.保存区域应有菌（毒）种及感染性样本检查、交接、包装的场所和生物安全柜等设备。

6.保存菌（毒）种及感染性样本容器的材质、质量应符合安全要求，不易破碎、爆裂、泄露。 7.保存容器上应有牢固的标签或标识，标明菌（毒）种及感染性样本的编号、日期等信息。 8.菌（毒）种及感染性样本在使用过程中应有专人负责，入库、出库及销毁应记录并存档。

9 .实验室应当将在研究、教学、检测、诊断、生产等实验活动中获得的有保存价值的各类菌（毒）种或感染性样本送交保藏机构进行鉴定和保藏。 10. 高致病性病原微生物相关实验活动结束后，应当在6个月内将菌（毒）种或感染性样本就地销毁或者送交保藏机构保藏。

11 .销毁高致病性病原微生物菌（毒）种或感染性样本时应采用安全可靠的方法，并应当对所用方法进行可靠性验证。销毁工作应当在与拟销毁菌（毒）种相适应的生物安全实验室内进行，由两人共同操作，并应当对销毁过程进行严格监督和记录。 12. 病原微生物菌（毒）种或感染性样本的保存应符合国家有关保密要求。

标准菌种的来源证明材料及菌株复苏说明书的归档 ； 菌种入库记录( 菌种 的名称或／和血清型、标准号、购置日期、来源、数量、审核人) ； 菌种领取记录( 菌种的名称 、标准号、领取日期 、领取数量 、 保存 形式 、领取人 、审核人 ) ； 菌种传代记录(菌种的名称、标准号、传代次数 、确认试验的结果、操作人、传代日期 ) ； 贮藏及保存环境记录 ；确认试验记录及销毁记录。

第三节 病原微生物样本的采集、运送和保存 传染病实验室诊断、传染源调查、自然疫源地监测、流行病学调查研究，都以检出特定的病原微生物或其相关物质为目的。样本来源主要为人和宿主动物、媒介昆虫，也包括水、土壤、食品等样本供调查传染源。

第三节 病原微生物样本的采集、运送和保存

2、病原微生物样本采集的一般注意事项 1）针对性：不要求样品代表性，强调针对性，尽可能采集病原微生物含量最多的部位。 2）足量：应采用足够检测用的样本，否则可能会得到假阴性结果。 3）多样性：应采集各种可能作为污染源的食物和环境样本，以及各种可能含有病原体的临床样本。 4）及时性：取样后应尽快测定，以利于疾病控制和患者的治疗。

3.临床样本的采集 所有临床样本以及其他用于微生物检验的样本都被视为具有传染性，严格按实验室生物安全操作程序采集； 采集样本是需注意：早、快、近（病变部位）、多、净；运送时注意包装要求，应放在带有盖扣的、内有固定架的标本运输箱中运输，盒外贴上生物危害的标识。 标本采集的部位、时间和质量是决定检测结果的第一要素。 临床样本：血液、体液、分泌物、排泄物及组织 若标本运输箱被标本污染，应立即用消毒液消毒，用 200mg/L 有效氯消毒液（朗索消毒片 4 片+1L 水）倾入标本运输箱内，浸泡 30-60分钟，再用流水冲洗 36

为分离样本中病原细菌或病毒，应根据样本运送时间的长短及不同病原微生物对干燥、温度、营养、pH 值的耐受能力，选择合适的培养基和推荐保存温度。 4.样本的保存： 为分离样本中病原细菌或病毒，应根据样本运送时间的长短及不同病原微生物对干燥、温度、营养、pH 值的耐受能力，选择合适的培养基和推荐保存温度。 临床样本：血液、体液、分泌物、排泄物及组织 37

样本贮存原则 （1）、基本要求 为防止蒸发和保证安全，样本应盛装在带螺旋盖的封闭容器中置冰箱内贮存，应根据样本的检验目的，进行适当的贮存。 （2）、严格管理 对样本贮存应严格管理，作好样本进出和储存的记录。对高致病性病原微生物菌（毒）种和样本应当设专库或者专柜单独储存，并制定严格的安全保管制度，建立档案 并指定专人负责。

检测后标本用保存袋封存统一保存至冷库,时限参见各专业实验室标准操作规程。 5.检测后标本的处理 检测后标本用保存袋封存统一保存至冷库,时限参见各专业实验室标准操作规程。 超过保存时限的标本通过安全方式进行销毁。参见《实验废弃物处置程序》。

样品转运包 ①样品转运箱 ②-95kPa样品密封袋 ③带螺口硬壁样品转运瓶 ④吸水性填充物 ⑤软性填充物 ⑥冰排

采样时二级生物安全防护 着装顺序：内防护服、帽子、N95口罩、第一层手套、外防护服、防护眼镜、胶靴、每二层手套 卸装顺序：脱第一层手套、防护眼镜、外防护服、脱胶靴、摘口罩、帽子、内防护服、第二层手套

二级防护示意图 戴护目镜 戴手套 穿防护服 穿鞋套

戴口罩的程序 1. 穿过口罩带托起口罩 2. 罩住口鼻 3. 固定颈部口罩带 4. 固定头部口罩带 5. 固定鼻夹 6.密合测试 卫生部：医院隔离技术规范，2009

（二）采集标本种类 1.上呼吸道标本：包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液和鼻洗液 2.下呼吸道标本：如气管吸取物、肺洗液、肺组织标本 3.血清标本：采集急性期、恢复期双份血清，发病7天内急性期血清以及间隔2-4 周的恢复期血清 4.尸检标本：肺组织、气管、支气管组织标本 应当尽量采集病例发病早期的标本

谢谢！