实验二.DNA浓度与纯度的测定
(一)DNA浓度的分光光度计测定 实验原理: 核酸的紫外吸收 实验原理: 核酸的紫外吸收 碱基含有共轭双键,使相关化合物在240-290 nm的紫外波段有强烈的吸收峰,最大吸收值在260nm左右
OD260的应用: 1. DNA或RNA的定量: OD260= 1.0相当于 2.判断核酸样品的纯度 50μg/ml双链DNA 40μg/ml单链DNA(或RNA) 20μg/ml单链寡聚核苷酸 2.判断核酸样品的纯度 DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0 含杂蛋白及苯酚, OD260/OD280降低
注意事项: 1.为防止读数漂移: 2.紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25 g/mL的核酸溶液。 选用TE缓冲液为溶剂(PH一定,离子强度低) 合适的稀释浓度,保证吸光值在0.1-1.5范围内 混合要均匀,无气泡和悬浮物,视窗干净 2.紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25 g/mL的核酸溶液。
操作步骤: 以TE缓冲液为空白对照; 将基因组DNA溶液分别用TE缓冲液稀释50倍、80倍、100倍至4ml,分别测OD260和OD280 ; 基因组DNA浓度为: OD260 ×核酸稀释倍数×50(μg/mL);样品各稀释级别算得的浓度平均值,即作为该样品的实际DNA浓度。 以OD260/OD280初步判断提取基因组DNA的纯度。
(二)DNA质量与浓度的琼脂糖 凝胶电泳法测定 实验原理: Ⅰ. pH>DNA PI,DNA带负电荷,阴极→阳极 Ⅱ. DNA在琼脂糖凝胶中的迁移率取决于: 1. DNA分子的大小 DNA迁移的速率与其碱基对数的常用对数成反比.
2. 琼脂糖浓度 浓度越大,DNA迁移率越低 3. DNA的构象 超螺旋环状>线状> 开环状 4.凝胶中、电泳缓冲液中的溴化乙锭 降低DNA的迁移率
5.电压: 低电压时,迁移率与电压成正比 适宜电压:5-8V/cm 6.电泳缓冲液: 离子强度适中 主要:TAE, TBE,TPE PH 7.5-7.8
TAE TBE和TPE 成 本 低 稍高 缓冲容量 低 高 DNA迁移率 快 慢 高分子量的 DNA分辨率 > 低分子量的 DNA分辨率 <
不同浓度琼脂糖分离DNA分子的范围 琼脂糖浓度(%) 分离范围(kb) 0.5 0.7-25 0.8 0.5-15 1.0 0.25-12 0.5 0.7-25 0.8 0.5-15 1.0 0.25-12 1.2 0.15-6 1.5 0.08-4
操作步骤 琼脂糖凝胶的制备:溶化,冷却,EB 凝胶板的制备:加梳子,倒胶 样品的制备:样品+1/5体积溴酚蓝 加样:加样端为负极(黑) 电泳:5V/cm 观察:紫外灯下观察,照相
准备胶槽
溶 胶
凝胶冷却至50°C,加EB至终浓度0.5μg/ml
铺 胶
凝胶凝固后取出梳子
加缓冲液
准备样品
凝胶上样缓冲液(6×) 蔗 糖 40% 溴酚蓝 0.25% (迁移率≈300bp双链DNA)
点 样
电 泳
注意观察溴酚蓝染液的迁移
紫外灯下观察电泳结果
照 相