流式细胞仪背景知识
总览 流式细胞术基本知识 流式细胞仪的组成 数据采集与分析
流式细胞技术是什么？ Flow Cytometry Flow:Fluid Cyto:Cell Metry:Measurement 流式细胞术 在流动的状态中检测细胞或颗粒的各项特性 特异性强，灵敏度高，速度快，并能实现多参数分析 可检测的样本种类多样：外周血，骨髓，细胞穿刺液，洗脱液，实体组织，培养细胞，微生物
流式细胞术检测样本 0.4um 40um
流式细胞术检测指标 流式细胞术提供的信息： - 相对细胞大小 - 相对细胞颗粒密度和内部复杂度 - 染色过细胞的相对荧光强度
流式细胞术的应用 在上述信号基础上的细胞分选 细胞结构 细胞大小 细胞粒度 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量 染色体分析 细胞功能 细胞表面/胞浆/核的特异性抗原 细胞活性 细胞内细胞因子 酶活性 激素结合位点 细胞受体 细胞凋亡 在上述信号基础上的细胞分选
流式细胞仪组成 液流系统：形成层流系统，聚焦细胞 光学系统：产生和收集光学信号 电子系统：光信号转化为电信号，进行信号处理
Fluidics Diagram Sheath Flow Sample Flow sheath tank test tube or plate sheath filter sheath interior reservoir sample injection tube (SIT) bubble filter flow cell interrogation point waste interior reservoir waste tank
液流系统
光学系统 激发光学系统包括: - 激光器 - 透镜和反射镜，将激光引导到检测区域 收集光学系统包括: 滤光片，将产生的光信号引导到对应的光学接收器
光学系统
光学系统-滤光片 Longpass Shortpass Bandpass LP 500 SP 500 BP500/50 460 500 540 460 500 540 460 500 540 LP 500 SP 500 BP500/50
电子系统 Laser Time Voltage
电子系统
电子系统
Review 液流系统 光学系统 电子系统 悬浮状态的细胞 单个流过流动室 细胞被激发 产生散射光和荧光 信号 信号被采集 转换成数字信号 产生散射光和荧光 信号 信号被采集 转换成数字信号 存储于电脑上 液流系统 光学系统 电子系统
回顾 流式细胞仪的三大组成部分？ 滤光片LP600代表什么意思？BP400/40呢？
数据采集 三种数据： - 前向散射光FSC - 侧向散射光SSC - 各种荧光散射光FL1，FL2，FL3，FL4
数据采集-前向散射光 当使用激光光源时，在前向方向（和激光行进的方向相同）上可用前向散射光接收通道接收到一定量的散射光 前向散射光的强度是和细胞或其他检测颗粒的大小、形状密切相关的
数据采集-侧向散射光 当激光光源被使用时，侧向也有一定量的散射光产生， 可以用90o 角的侧向散射光检测通道来采集 侧向散射光的强度和细胞或其他检测颗粒的颗粒密度、内部复杂程度密切相关
颗粒杂质、气泡 对检测的影响 外周全血细胞散射光双参数点图
数据采集-荧光信号 细胞标记上荧光物质后，这种荧光物质要求特定波长的激发光来激发，同时发出特定波长的光 荧光物质被激发以后产生的发射光将由特定的荧光通道来接收 特定检测是通过光学滤片和透镜来控制的 荧光强度是和细胞上标记上的荧光染料的量正相关
数据采集
电压 信号放大方式：log、lin 信号类型：A,W,H 电压的调节:根据阴性对照管来调节
阈值 可以以任意参数及多个参数的组合作为阈值 大多数样本都可以设定FSC/SSC 阈值以下的信号不存储 根据阴性对照管来调节 目的是将不需要的杂质信号，噪音信号，无用的细胞信号等扣除，使收集到的都是有用信号
补偿 补偿方式：任意两个通道之间，可以采用手动或自动补偿。 补偿的调节:根据单染对照管来调节
1.) Compensation - Too Little; Too Much
2.) Basic Principles of Compensation - % Compensation is independent of fluorescence intensity
3.) Compensation- Too Dim, Too Bright Compensation Controls Small errors in compensation of a dim control (A) can result in large compensation errors with bright reagents (B & C).
数据分析 流式数据 直方图 散点图 等高线图 密度图 三维图 统计数据
直方图 直方图(Distribution Histogram) 横坐标代表荧光信号或散射光信号相对强度，单位是对数，可以是线性或对数坐标。 纵坐标一般是细胞数。
散点图 散点图(Dot Plot) X坐标为该细胞一参数相对含量，Y坐标为该细胞另一参数的含量，可以将细胞亚群分开。
等高线图和密度图
三维图
统计数据 Events 百分比 平均荧光强度 荧光中位值 CV SD ……
数据获取与分析 电压 阈值 补偿 获得数据 画图 设门 统计
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