HPLC的结构与原理 河南省兽药饲料监察所 方忠意 2015年4月15日

历版《中国兽药典》使用 液相色谱法品种数量 药典版本 鉴别 检查 含量测定 总计 2000年版 / 31 18 49 2005年版 86 85 91 262 2010年版 143 229 154 526

“色谱”的来源

色谱法 色谱法是一种分离分析方法，分离的过程是化合物与固定相与流动相互作用的过程。 固定相 化合物 流动相 Text 流动相：指色谱过程中携带组分向前移动的物质。 固定相：指色谱过程中不移动的具有吸附活性的固体或是涂渍、键合在载体表面上的物质。

分离的机理 当流动相中携带的混合物流经固定相时，其与固定相发生相互作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和） 。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而按一定次序由固定相中流出。

色谱的分类 气相色谱：流动相为气体 液相色谱：流动相为液体 超临界色谱：流动相为超临界流体（在 按流动相分： 高于临界压力与临界温度时，物质的一 种状态，性质介于液体和气体之间）

高效液相色谱的分类 按色谱过程的机理分类： 吸附色谱：以吸附剂为固定相，利用吸附剂对不同组分吸附力的强弱差异进行分离的过程 分配色谱：以液体作为固定相，根据各组分在两相中溶解度的不同进行分离的过程 离子交换色谱：用一种能交换离子的材料作为固定相，根据各组分的离子交换能力的差异进行分离的色谱过程；用于无机离子、氨基酸等的分离 体积排阻色谱：固定相为一种分子筛或凝胶，根据各组分分子的大小差异进行分离的方法 亲和色谱：是一种利用固定相的结合特性来分离分子的色谱法。通常用于分离核酸、蛋白等物质

高效液相色谱 经典液相色谱法使用粗粒多孔固定相，装填在大口径、长玻璃柱管内，流动相仅靠重力流经色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度缓慢，柱入口压力低，仅有低柱效，分析时间冗长。 高效液相色谱法使用了全多孔微粒固定相，装填在小口径、短不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵进入高柱压的色谱柱，溶质在固定相的传质，扩散速度大大加快，从而在短的分析时间内获得高柱效和高分离能力。

高效液相色谱的特点 分离效率高 检测灵敏度高 分析速度快 应用范围广

高效液相色谱仪的基本结构

高效液相色谱仪的基本结构 控制及数据处理系统 输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 输液泵，脱气机，在线过滤器、梯度阀，混合装置 色谱柱、预柱，柱温箱连接管和恒温器、柱温箱 进样器 样品舱 检测器

输液泵的组成 单向阀 单向阀一般由阀体、阀座和（红宝石或陶瓷制作的）耐磨阀球组成 密封圈 柱塞杆 泵头清洗管路

单向阀结构原理 （被动）单向阀原理 单向阀结构 吸液冲程 排液冲程 出口单向阀 进口单向阀 泵头 抛光面 宝石球 球座 （主动）单向阀

泵工作示意图

梯度比例阀 梯度比例阀一般是四个通道（A\B\C\D）入口，控制各个通道的开关时间或开关频率，来实现不同流动相的比例

溶剂混合器 液相色谱用在线混合器都是静态混合器，混合器本身没有运动部件，而是依靠固定在管内结构特殊的内件和流体的运动，使不同的流体达到良好的混合 混合方式： 低压混合 高压混合

进样器 HPLC主要是采用六通阀进样器 六通阀进样器是高效液相色谱系统中最理想的进样器，它是由圆形密封垫(转子)和固定底座(定子)组成

六通阀工作原理 手柄位装样(Load)位置时，样品经微量进样针从进样孔注射进定量环，定量环充满后，多余样品从放空孔排出 将手柄转动至进样(Inject)位置时，阀与液相流路接通，由泵输送的流动相冲洗定量环，推动样品进入液相分析柱进行分析

色谱柱 色谱柱一般由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、填料、螺丝等组成。 色谱柱规格表示方式：品牌、型号、填料类型、粒径、内径、长度。 如：Waters Xbridge C18(5μm，4.6 ×150mm)

液相色谱柱的分类与应用范围 硅胶基质柱（4大类） 按照基质种类进行分类 目前，分析型液相色谱柱多为硅胶基质柱，细分为： 高纯硅胶柱：以高纯度硅烷化硅胶（Silica）为填料，但只能在PH2~8，小于60℃的条件下使用。又由于强极性硅羟基（Si-OH)的次级保留效应较强，所以应用受到局限，已被键合相柱所取代。 反相硅胶柱：是以硅烷化硅胶为基质，表面键合弱极性官能团的固定相。目前多用C18（ODS）、C8（MOS）、C4（B）、C6H5（phenyl，苯基）等。用于分离大多数有机化合物，应用范围最广。

正相硅胶柱：是以硅烷化硅胶为基质，表面键合极性官能 团的固定相。目前较多的为：NH2—（氨基）、CN—（氰基）。多用于分离光学异构体和反相柱子不能分离的极性比较大的物质 。 离子交换柱：是以硅烷化硅胶为基质，以磺化交联键合强阳/阴离子基团（磺酸盐/季铵碱）的固定相，又分为强酸性、强碱性、弱酸性、弱碱性等不同规格。用于分离解离性较强的有机盐类化合物。

聚合物基质柱 聚合物基质柱是指采用聚苯乙烯—二乙烯基苯、聚甲基丙烯酸脂、多孔性微球蛋白等聚合物凝胶作为主要填料的一类色谱柱。其相对于硅胶柱具有更强的疏水性及更宽泛的pH范围（1.0～14.0），但柱效较低，目前主要应用于凝胶渗透色谱（GPC）、凝胶过滤色谱（GFC）及分子排阻色谱（MEC）。主要用于分离蛋白质类等大分子化合物。 其他无机物填料柱 这类色谱柱仅限于特殊用途，主要有石墨化碳、氧化铝（Al2O3）、氧化锆（ZrO2）等填料。不需要进行表面改性，其自身表面即可对各类化合物有强保留。可在任意pH（氧化铝除外，不能大于12.0）及高温度（可达100℃）下使用。其中，石墨化碳填料柱能分离多种化合物，主要用于分离几何异构体；氧化铝柱刚性强，柱床稳定，可分离多种化合物且多用于制备色谱；氧化锆柱较氧化铝柱有更强的pH适用范围及能耐受更高的温度，但其应用尚待进一步研究。

检测器 检测器是HPLC仪的三大关键部件之一。其作用是把洗脱液中组分的量转变为电信号。HPLC的检测器要求灵敏度高、噪音低（即对温度、流量等外界变化不敏感）、线性范围宽、重复性好和适用范围广。 HPLC常用的检测器有如紫外（二极管整列）、荧光、示差折光、蒸发光散射、电化学检测器和质谱检测器。

各种检测器的特点 信号 类型 流速影响 温度影响 梯度洗脱 响应值-浓度 样品破坏 噪音 线性范围 检测限(g/ml) 紫外 荧光 示差折光   紫外 荧光 示差折光 蒸发光散射 电导 质谱 信号 吸光度 荧光强度 电流 散射光强 电导率 离子流强度 类型 选择性 通用性 流速影响 不敏感 敏感 温度影响 梯度洗脱 可以 不可以 响应值-浓度 线性 指数 样品破坏 无 破坏 噪音 10-5 10-3 10-9 - 线性范围 105 104 检测限(g/ml) 10-10 10-11 10-7

紫外-可见光检测器 基于样品池(S)中的样品对特定波长紫外光的选择性吸收。 定量基础：朗伯-比耳定律，A＝kCL 优点：1）灵敏度高 2）对温度和流速不敏感 3）可用于梯度洗脱 缺点：仅适用于测定有紫外吸收的物质

二极管阵列检测器

二极管阵列检测器的优点 采集三维谱图 峰纯度检验 光谱库检索 可以发现单波长检测时未检测到的峰

荧光检测器 原理：基于被分析组分发射的荧光强度进行检测 优点：1）灵敏度高，是最灵敏的检测器之一 2）选择性好 3）对温度和流速不敏感，可用于梯度洗脱缺点：仅适用于测定可产生荧光的物质􀂙

示差折光检测器 原理：连续测定流通池中溶液折射率来测定试样中各组分浓度。􀂙 优点：通用型检测器􀂙 缺点：1）对温度变化敏感 2）对溶剂组成变化敏感，不能用于梯度检测 3）属于中等灵敏度的检测器

电导检测器 原理：根据物质在某些介质中电离后所产生的电导率的变化来 测定电离物质含量 优点：对流动相流速和压力的改变敏感，不适用于梯度洗脱 缺点：对温度变化敏感，测量时要保持恒温 用途：主要用于离子色谱，检测无机和有机离子

蒸发光散射检测器 原理: 流出物在检测器中被高速氮气喷成雾状液滴，溶剂 挥发后，溶质形成微小颗粒，被载气带到检测系统， 进入散射室中，检验散射光的强度。 优点: 消除了溶剂干扰以及温度变化带来的基线漂移 可梯度洗脱，灵敏度高 是HPLC的通用型检测器 缺点： 不能使用不挥发性盐作流 动相，如磷酸盐

质谱检测器 原理：利用电磁学原理，对带点粒子依其质量和电荷的比值（质荷比，m/z）进行分离和分析的方法。 优点： 强大的定性和选择性能力 ----多组份样品的准确定性 ----未充分分离组份峰的鉴别 ----消除杂质干扰 缺点：仪器价格昂贵 使用和维护成本 操作相对复杂