实验一 双水相萃取
实验目的 1）掌握双水相萃取技术的基本原理和主要影响因素。 2）了解目标产物的性质如等电点、电荷和分子量等。 3）掌握熟悉聚乙二醇（PEG）/硫酸铵体系双水相萃取实验操作。 4）明确硫酸铵浓度等因素对α-淀粉酶分配系数的影响。
实验器材和试剂 1. 实验器材:低速离心机；涡流混合器；分光光度计 2. 实验试剂:PEG：4000、硫酸铵、α-淀粉酶、考马斯亮蓝 G-250
实验原理 双水相萃取技术在萃取胞内酶中应用广泛，最常采用的双水相体系是PEG/Dex或PEG/低分子盐系统，其中低分子盐最常采用的是硫酸铵、磷酸钾和硫酸镁。
PEG/磷酸钾双水相体系相图如上所示。T为上相浓度，B为下相浓度, C为系统临界点，TCB为临界线或双节线，双节线以上为两相区、以下为一相区或均相区。因此两相浓度要足够高才可以形成两相。双水相萃取分配系数K=Ct/Cb，为上相和下相的浓度比。 双水相系统分配系数的影响因素包括系统本身的因素如系统组成、聚合物分子量、聚合物浓度、盐和离子强度、pH等，以及目标产物的性质如疏水作用、电荷、等电点和分子量等。利用双水相技术可以获得特定蛋白质和生物大分子的最适宜分离的相系统和最优分配。 相图中TMB为系线，其长度由相组成的总浓度决定，表征两相差异程度。在临界点附近系线长度趋近于零，表示上相和下相的组成相同，因此分配系数应为1。随着PEG、硫酸铵和盐浓度增大，系线长度增加，上相和下相相对组成的差别就增加，酶在两相中的分配系数会受到极大的影响。 本实验采用PEG/硫酸铵双水相体系研究α-淀粉酶的分配，具体研究PEG分子量、硫酸铵浓度、pH和添加NaCl浓度对α-淀粉酶分配系数的影响。
实验步骤 前步骤1： 40%PEG4000 1000mL。配制：称取400g的PEG(MW=4000)放入烧杯或锥形瓶中，在沸水中加热溶化。待冷至50℃时，加入600ml并预热至50℃的水。
前步骤2： 1%α-淀粉酶100mL酶液的制备： 精确称取α-淀粉酶2g，先用少量40℃pH6的磷酸二氢钠——柠檬酸缓冲液溶解，溶解过程中轻轻用玻璃棒捣研。将上层液小心倾入100ml容量瓶，沉渣部分再加入少量上述缓冲液，如此反复捣研3—4次。最后，将溶液与残渣全部移入容量瓶中，用缓冲液先定容摇匀后，通过四层纱布过滤，溶液供测定使用。
1. PEG/硫酸铵双水相体系相图绘制 配制40%PEG4000和43%硫酸铵原液（没有混合前的液体，混合后浓度是相图中最终浓度），取0.7g PEG4000原液（PEG4000密度为1.03 g/mL,因此加入0.7g的体积为0.68 mL、），加入0.5mL水，按图1流程绘制相图，按表1记录数据。注意少量多次加入硫酸铵原液，系统出现浑浊时记录加入硫酸铵体积，计算重量（43%硫酸铵原液密度为1.2g/mL）,再加入适量水，使体系变澄清，计量加入的水，再加硫酸铵，使系统再次变混浊，如此反复操作，原液冰箱放置。将数据记录到表1中，计算系统混浊不同时刻PEG和硫酸铵在系统中的质量百分浓度（或质量体积百分比），绘制PEG和硫酸铵的双水相相图。
图1 PEG/硫酸铵双水相相图绘制流程 0.700g H2O 0.5ml (NH4)2SO4 H2O 0.3/0.5ml 混和 H2O 0.3/0.5ml 浑浊 记录(NH4)2SO4 ml数 混均 澄清 旋涡器 图1 PEG/硫酸铵双水相相图绘制流程
表1 PEG/硫酸铵双水相体系相图绘制数据 次数 H2O加量 （g） (NH4)2SO4溶液加量 纯（NH4)2SO4 累计量（g或mL） 溶液累计 总量（g或mL） PEG4O00(%) (NH4)2SO4(%) （mL） (g) 1 0.5 2 0.3 3 4 5 6 表1 PEG/硫酸铵双水相体系相图绘制数据
2.不同硫酸铵浓度对双水相萃取α-淀粉酶分配系数的影响 振摇混和 (固体溶解) 15ml刻度 离心试管 (NH4)2SO4 4.00mL 4mL PEG4000 淀粉酶 0.5ml 水 总重8.5mL 离心 3000转/分 4 min 求相比 R =V上/V下 求蛋白质 分配系数 K = C上/ C下
表2 不同硫酸铵浓度对α-淀粉酶分配系数 硫酸铵浓度 g/mL 上相酶吸光度 上相酶浓度 下相酶吸光度 下相酶浓度 分配系数 20.0% 表2 不同硫酸铵浓度对α-淀粉酶分配系数 硫酸铵浓度 g/mL 上相酶吸光度 上相酶浓度 下相酶吸光度 下相酶浓度 分配系数 20.0% 30.0% 40.0% 50.0%
取4mL40%PEG4000 4份，按表2分别加入不同浓度4mL硫酸铵原液，再加入0 取4mL40%PEG4000 4份，按表2分别加入不同浓度4mL硫酸铵原液，再加入0.5mL淀粉酶用于双水相分配，置于15mL刻度离心管中充分混合(盖上盖子使劲上下摇！！！)。 另取4mL 40%PEG4000 1份，加入0.5mL水和4mL 20%硫酸铵原液做上下相空白样，置于15mL刻度离心管中充分混合(盖上盖子使劲上下摇！！！) 将五份溶液于3000r/min离心4min，读出上下相体积，计算相比
小心吸取上相1mL,加入3mL考马斯亮蓝，测定595nm下的吸光度A值。移去上相，弃去相界面处液体和少量下相，小心吸取下相1mL,加入3mL考马斯亮蓝（振荡试管，充分混匀！！！），测定595nm下的吸光度A值。按标准曲线方程 Y= 0.8292 X + 0.0272计算浓度和α-淀粉酶分配系数。