《细胞与显微技术实验》 实验九 动物骨髓细胞染色体的制备
一、实验目的和要求 了解制备中期染色体标本的原理 掌握动物骨髓细胞染色体标本的制备技术 观察染色体的数目以及形态特征
二、实验原理 在正常动物细胞中，骨髓是处于不断分裂的组织之一，骨髓细胞中的造血干细胞是生成各种血细胞和原始细胞，具有高度的分裂活性并且数量非常多。处于分裂期的细胞经秋水仙素或秋水酰胺处理后，由于阻断了纺锤丝微管的组装，使分裂细胞阻断在有丝分裂中期，此时染色体达到最大收缩，具有典型的形态，再经离心、低渗处理及固定、滴片、染色等步骤，便可制作较好的骨髓细胞的染色体标本。
三、实验用品 材料 2. 器具: 解剖器具、注射器(2 mL) 、离心机、刻度离心管、 玻璃吸管、载玻片、盖玻片、显微镜、恒温水浴锅 等。 牛蛙。 2. 器具: 解剖器具、注射器(2 mL) 、离心机、刻度离心管、 玻璃吸管、载玻片、盖玻片、显微镜、恒温水浴锅 等。 3. 试剂: 2 mg/ml 秋水仙素溶液、固定液 (甲醇：冰醋酸＝3：1)、0.075 mol/L的KCl低渗溶液、Giemsa染液、磷酸缓冲液(pH 7.2)、0.85%生理盐水等。
四、实验步骤 1、秋水仙素处理：实验前一天晚上，按照青蛙每克体重4 ug的剂量，腹腔注射秋水仙素。 2、取股骨：将牛蛙处死，迅速取出股骨（为了获得较多的骨髓细胞胫骨亦可使用），用剪刀和纱布剥去全部肌肉组织，用骨剪剪开长骨两端的膨大部半透明软骨（不能全部剪断），程度以刚刚露出红色的骨髓组织为宜。收集前后肢提取6根骨头（每组3根）。
每组同学取前肢、后肢各一，获取长骨3根 上肢1 下肢2
四、实验步骤 3、取骨髓：用2 mL注射器吸取生理盐水2 mL，将针头插入骨髓腔，将红骨髓细胞冲入35 mm培养皿内，反复几次，直至骨头变白（需将随骨髓冲出物中大块白色脂肪组织用镊子挑出），将一只牛蛙的所有骨髓细胞集中在一只离心管中，吸打骨髓细胞，使细胞团块分散。 注意：冲洗时动作要徐缓，以免溶液喷出，损失骨髓细胞
四、实验步骤 4、将骨髓细胞悬液转入2只1.5 mL离心管中（等体积，保证离心平衡），以1500 rpm离心10 min，弃去上清液. 5、低渗：每管加入0.5 mL KCL溶液，吸打混合均匀，将两管合并成一管，37℃水浴低渗25 min。（细胞膨胀，使滴片时细胞膜破碎，染色体分散） 6、固定：将低渗处理后的细胞悬液2000 rpm离心6 min，小心吸去上清液（弃去）,每管加入新鲜配置的甲醇：冰醋酸（3：1）1 mL，用移液器将细胞轻轻吸打均匀，固定15 min。（固定细胞形态，阻止染色体收缩，使染色体结构免于破坏） 7、重复上面步骤一次。 8、 2000 rpm离心6 min，小心吸去上清液（每管约900 µL），留少量残液用吹打法将沉淀制备成细胞悬液。 9、滴片：在预先冷冻，用酒精浸泡的载玻片上，滴加1-3滴上层细胞悬液，在烘箱中烘干。 10、染色：将玻片平放于支架上，细胞面向上，每片滴加Giemsa染液数滴，染色10~20 min。 11、镜检：在自来水管下冲洗数秒，去掉染液，在烘箱中烘干，滴加甘油后盖上盖玻片，显微镜观察。
滴片的制作 0.5~1 m
镜检观察 首先在10倍镜下观察标本，应背景清晰，杂质较少，细胞分散良好。10倍镜下找到松散的细胞团，类似于线团，其染色比较致密的细胞核颜色浅。 转到40倍镜下，应能看到成X型的中期染色体，如分散较好的图像可以看清结构并数清其条数。在40倍镜下找到清晰图像后，可直接拍照保存，并记录下该图像大致位置(载物台上标本移动轴上对应位置)。 在40倍镜下将图像移至视野正中央，再下降载物台，滴香柏油转油镜观察图像，拍照保存。 观察完毕立即清理油镜镜头! 注意滴了油的载玻片不能在40倍镜下观察!
五、实验结果 优良制片标准 : 单个细胞的染色体较集中，各染色体分散均匀且互不重叠，染色体长度适中，呈蓝紫色，能清晰显示着丝点位置。 牛蛙染色体2n=26
牛蛙骨髓细胞染色体核型（2n=26）
六、注意事项 1、低渗与离心等步骤的操作要轻。 2、低渗处理极为重要，其目的是使细胞体积胀大，染色体松散。低渗不够，则染色体聚在一起，分散不好。太过，则造成细胞破碎，染色体丢失。 3、固定液要现配现用，固定彻底后再打散细胞团块，否则细胞容易破碎，染色体分散亦收到影响。 4、载玻片要预冷，冷却不够，则会影响染色体的附着和铺展。
七、作业 绘制染色体图并作简要分析。 例如：细胞密度是否适中，分裂细胞的比例如何，处于分裂中期相的细胞数量情况，染色体形态、数目、有否重叠等。