成员：2008级生物工程 王佳宁 2008级生物工程 漆亚乔 2008级生物技术 李芮 题目：木瓜酶活性的提高 对蛋白质水解效果 成员：2008级生物工程 王佳宁 2008级生物工程 漆亚乔 2008级生物技术 李芮
实验目的： 以未成熟的青果木瓜浆汁为原料，提取木瓜酶（木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶A、木瓜凝乳蛋白酶B及木瓜肽酶）。通过利用适量的激活剂，提高木瓜酶的活性，得到更好的蛋白质水解能力。寻找最适激活剂，在生产、应用中尽量避免加入抑制剂。
方法： 收集新鲜木瓜乳汁，处理后得到木瓜酶液。向酶液中加入不同添加剂（激活剂或抑制剂），与酪蛋白底物反应相同时间，通过测定反应后酪氨酸的含量，说明不同添加剂对木瓜酶催化反应的影响。
实验步骤： 取青木瓜浆汁 制成浊液 过滤 取滤液透析 绘制酪氨酸标准曲线 制成酶液 根据标准曲线，分析不同添加剂的作用机理 在不同添加剂环境下测定酶活
绘制酪氨酸标准曲线： 500ug/ml酪氨酸溶液 a.取9支试管，编号，按下表格加入试剂。 单位：(ml) 1 酚试剂 5 碳酸钠溶液 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 蒸馏水 0.1 500ug/ml酪氨酸溶液 8 7 6 4 3 2 试剂 b.振荡、置于30℃恒温水中显色15min c.用分光光度计在A680nm处测定680nm的光吸收值 d.以酪氨酸含量为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制酪蛋白的标准曲线, 根据散点写出回归线性方程。
不同添加剂环境下酶活力的测定： 试剂 1 2 3 4 5 6 7 8 蒸馏水 木瓜酶液 Na2S03 EDTA二钠 CuSO4 ZnSO4 1 2 3 4 5 6 7 8 蒸馏水 木瓜酶液 Na2S03 EDTA二钠 CuSO4 ZnSO4 酪蛋白 55℃水浴反应10分钟后，用2ml 10%三氯乙酸沉淀蛋白质 过滤，取滤液2ml 碳酸钠 酚试剂 用分光光度计在A680nm处测定光吸收值。
有蛋白无酶 1 无蛋白有酶 2 无添加剂 3 Na2S03 4 EDTA二钠 5 CuSO4 6 ZnSO4 7 8 现象 (白色沉淀) ++++++ +++ ++ + +++++ ++++
1 2 3 4 5 6 7 8 现象 ++ + ++++ +++++ +++ OD值 0.314 0.067 1.378 2.462 0 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 现象 (浅蓝--灰蓝--深黑蓝) ++ + ++++ +++++ +++ OD值 0.314 0.067 1.378 2.462 1.720 0.812 0.694 0.754 0.562
0号 2号 3号 4号 5号 6号 7号 8号 试管0为无酶管，用于测定酪蛋白中的还原性物质，以排除干扰。 试管2为普通管，即酶与蛋白质直接反应，用于作为不同添加剂的参考。 试管2为普通管，即酶与蛋白质直接反应，用于作为不同添加剂的参考。 试管3添加还原性物质。加入的Na2SO3溶液使—S—S—或—S02H—还原成蛋白酶的活性中心巯基—SH，增大了酶的催化能力 。 试管4添加螯合物。加入的EDTA二钠试剂，螯合与酶活性中心结合的重金属离子，增大了酶的催化能力 试管5加入金属抑制剂CuSO4。重金属Cu2+会使酶变性，抑制催化作用。 试管6加入金属抑制剂ZnSO4。Zn2+为两性金属离子，对酶活性中心有影响，抑制催化作用。 试管7加入金属抑制剂CuSO4和等量的EDTA二钠试剂。 酪氨酸的生成量比试管5（只加入金属抑制剂CuSO4 ）的要多。EDTA二钠可螯合与酶活性中心结合的Cu2+，减小Cu2+对酶活性的影响。 试管8加入金属抑制剂ZnSO4和等量的EDTA二钠试剂。 酪氨酸的生成量比试管6（只加入金属抑制剂ZnSO4 ）的要多。 EDTA二钠可螯合与酶活性中心结合的Zn2+，减小Zn2+对酶活性的影响
不同添加剂作用后的OD值 小 大 有蛋白 无酶 5 CuSO4 2 无添加剂 3 Na2S03 1 无蛋白 有酶 8 ZnSO4 有蛋白 无酶 5 CuSO4 2 无添加剂 3 Na2S03 1 无蛋白 有酶 8 ZnSO4 EDTA二钠 7 CuSO4 EDTA二钠 6 ZnSO4 4 EDTA二钠
结论： 在55℃水浴条件下，木瓜酶与足量底物反应10min，得到的酪氨酸用酚试剂测定其含量。根据OD值计算可知： Na2SO3和EDTA二钠可以提高木瓜酶活性，分别提高78.7%和24.8% Cu2+和Zn2+的引入会降低木瓜酶的活性，分别减小41.1%和49.6% 在纯木瓜酶的反应中可得知： EDTA二钠可与金属离子螯合，降低金属对酶活的影响。 但是加入顺序不同效果就不一样。 先Cu2+后EDTA二钠，Cu2+使酶变性； 先EDTA二钠后Zn2+，有效保护酶活性。
我们的意外发现 Na2CO3 K2HPO4 K2CO3 KCl
谢谢