基因工程操作的基本技术

主要内容 凝胶电泳技术 核酸提取技术 基因工程技术  PCR技术 DNA重组技术 重组子克隆 核酸杂交技术 基因文库构建

第一节 基因工程的基本技术 之一

一、核酸提取技术  核酸包括脱氧核糖核酸（ DNA ）和核糖核酸（RNA）;  脱氧核糖核酸（ DNA ）包括线状基因组DNA和环状DNA（质粒DNA）。

1、植物组织中基因组DNA的提取 思考：DNA如何从细胞中取出？

ⅰ植物组织中基因组DNA的提取原理： 用机械研磨使组织和细胞破碎，然后加入SDS、CTAB等离子型表面活性剂，使细胞膜和核膜破裂，解聚核中的核蛋白（并与蛋白质形成混合物），然后在酚和氯仿等表面活性剂的作用下使蛋白变性，再经离心除去组织和变性蛋白，上清液加乙醇使DNA沉淀。

再思考： 1、研磨破碎组织必 须在低温下进行。 ------为什么？ 防止DNA降解。 2、幼嫩组织DNA 的得率高还是低？ 得率高！

ⅱ 提取DNA的质量鉴定： DNA的相对完整性：凝胶电泳 DNA的纯度：测OD值 吸收峰： DNA 紫外光260nm 蛋白质 紫外光280nm 比值： OD260/280 = 1.8-2.0 较纯 OD260/280 < 1.8-2.0 杂质多

2、质粒DNA的提取 质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。 基因组DNA 质粒DNA 质粒具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。

ⅰ质粒DNA提取方法： 碱裂解法、煮沸法、 SDS法等 ⅱ 碱裂解法原理： 在碱性条件下，双链DNA氢键断裂，结构破坏变性，环状超螺旋质粒不充分变性。在中性条件下变性质粒恢复原来构型，而线性大分子细菌DNA不能复性呈不溶物而经离心除去。

抽提质粒DNA所需的溶液： §、溶液Ⅰ：50 mol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-Cl （pH8.0），10 mmol/L EDTA (pH8.0)； §、溶液Ⅱ： 0.2 mol/L NaOH， 1%SDS(w/v)， 现配现用； §、溶液Ⅲ：3 mol/L KAc，用冰醋酸调pH值至 5.2；

实验步骤 1、接种、摇菌； 2、把菌液放入Ep管中，离心，弃上清； 3、加入200μL预冷的含Rnase的溶液I，涡旋混匀； 4、加入200μL的溶液Ⅱ，温和混匀，室温静置5min； 5、加入200μL的溶液Ⅲ，温和混匀，冰浴15min； 6、离心，吸上清至另一EP管；

7、加等量的氯仿/异戊醇（V：V=24：1）抽提，离心； 8、移取上清液，加入2倍体积无水乙醇，混匀，-20℃静置5min，离心，弃上清； 9、用70%乙醇洗DNA沉淀2次，离心，倒掉乙醇，吹干； 10、用TE（pH8.0，）溶解质粒DNA，并加入RnaseA达浓度为10μg/ml，37℃放置1小时 11、取1μL质粒DNA用于电泳检测。

ⅲ 抽提出质粒的构型： 1）超螺旋质粒DNA:在提取质粒过程中，超螺旋DNA占大部分。 2）开环质粒DNA：如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成松驰型的环状分子，称开环DNA。 3）线状质粒DNA：如果质粒DNA的两条链在同一处断裂，则形成线状DNA。

1）开 环 2）线 状 3）超螺旋 + - 电泳方向 抽提出的质粒三种构型电泳结果：

DNA的浓缩与纯化（P31-33） ♪ DNA的浓缩： ＠ 乙醇沉淀法 ＠ 正丁醇抽提法 ＠ 聚已二醇浓缩法 ♫ DNA的纯化： ＠氯化铯－溴化已锭连续梯度离心法 ＠离子交换层析法 ＠琼脂糖凝胶电泳洗脱法 ＠“基因纯”试剂纯化

二、凝胶电泳技术 电泳目的：对核酸分子进行分离和检测

核酸分子分离的原因： 在碱性环境下，核酸分子带负电荷，在外加电场的作用下，分子在凝胶多孔性刚性滤孔中从负极向正极泳动，其中主要由于分子筛效应和电荷效应达到分离不同大小核酸分子的目的。 电泳类型： 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳

（一）、影响电泳迁移率的因素 1、分子本身的影响 分子的大小：小则快 带电荷数：多则快 分子构型：超螺旋>解螺旋 2、电场：直流电场 电压高则快 电压太高则结果不准确 常用3~5V/CM

3、支持物介质 A 种类： 琼脂糖（agarose）凝胶： 操作简单； 分辨范围：100bp-60kb；  有效范围：200bp-50kb；  分辨率：100bp左右 低熔点琼脂糖：用于DNA的回收（65℃）

聚丙烯酰胺凝胶： 常用于微卫星、测序分析； 分辨范围：5-500bp；  分辨率：1bp 注意：有神经毒性！！

B 凝胶浓度:  浓度大，筛孔小，适合小分子电泳；  浓度小，筛孔大，适合大分子电泳 ♦ 凝胶分辨DNA的能力： 琼脂糖 聚丙烯酰胺凝胶 浓度 分辨范围(kb) 浓度 分辨范围(bp) 0.3% 5-60 3.5 1000-2000 0.6% 1-20 5 90-500 0.7% 0.8-10 8.0 60-400 0.9% 0.5-7 12 40-200 1.2% 0.4-6 15 25-160 1.5% 0.2-3 20 6-100 原来如此！ 凝胶浓度的选择：取决于待检测的DNA的大小

4 、电泳缓冲液  pH值：偏碱性，带负电荷  离子浓度：离子浓度高 电流大 发热快胶溶解  种类： TAE （Tris+EDTA+醋酸）:电流大，易产生离子富集 TBE （Tris+ EDTA+硼酸）:缓冲能力最强 TPE （Tris+ EDTA+磷酸）:缓冲能力低 TNE （Tris+ EDTA+醋酸钠）

电泳缓冲液的选择 ☆ 实验技巧： ☻问题：电泳缓冲液使用一定时间后由于离子的富集作用，DNA在凝胶中出现跑不动现象。 TBE缓冲力大于TAE； 高分子量的DNA选用TAE，否则选用TBE； 基因组DNA酶切电泳选用TAE； 大家注意了！ ☆ 实验技巧： ☻问题：电泳缓冲液使用一定时间后由于离子的富集作用，DNA在凝胶中出现跑不动现象。 解决办法： 一是更换成新配置的电泳缓冲液； 二是把电泳槽中倒出混匀后重新使用。－－－WHY?

（二）、电泳指示剂和DNA染色剂  电泳指示剂 Ⅰ、类型：溴酚兰，二甲苯青 Ⅱ、作用： (1) 预知电泳的速率及方向； (2) 使样品呈现颜色，便于加样； (3) 与一些高浓度蔗糖或其它物质增加DNA的密度。

 DNA染色剂  荧光染色剂,溴化已锭： （ EB, Ethidium bromid） 吸收300~360nm UV（紫外光）  硝酸银：常用0.1%  Goldview染料 吸收紫外光，放出绿光（双链DNA）或橙红色光（单链DNA）

（三）凝胶电泳过程 1、制胶：称取一定量的琼脂糖用电泳缓冲液融解后倒入制胶槽配制； 2、放胶：胶放入电泳槽，加入电泳缓冲液至没过胶2－3mm, 3、点样：把DNA样品加入上样缓冲液混匀上样 4、电泳：接通电源，调好电压 5、看结果：紫外光观察。

（四）、电泳种类 1、单向电泳 2、脉冲电场电泳（CHFE） － ＋ 3、反转电场电泳（FIGE）

技术3： PCR技术 (polymerase chain reaction)  中文名称：聚合酶链式反应  1、PCR原理： 变性温度下， DNA双链变性双螺旋解开成单链DNA，在退火温度中人工合成的特异引物根据碱基互补配对原则与单链DNA特异结合，然后在DNA聚合酶的作用下，在延伸温度下不同的脱氧核苷酸按照碱基互补配对原则在引物的引导下合成与模板DNA互补的新链，实现DNA的扩增。

 2、 PCR反应过程： 变性：DNA双链变为单链； 退火：引物与模板结合； 延伸：合成互补链；

 3、 PCR反应体系： 体系成分：模板DNA、引物、Taq酶(热稳定性)、 dNTP、反应缓冲液（Mg2+ 、 BSA、Tween20、DTT 、 Tris.cl ） 。

1）、引物（寡聚核苷酸） §一般成对出现，长度为15-30个核苷酸； § 使用浓度： 0.1-0.5uM，高达1uM； § 引物设计原则： 1、G+C含量45-55%； 2、Tm值高于55； 3、引物特异性； 4、引物扩增跨度； 5、是否形成引物二聚体

§基因组DNA、质粒DNA、其它DNA片段； §质量要求：不高 3）、Taq酶(热稳定性)： §常规酶 §高保真酶：ExTaq §La Taq酶 4）、反应缓冲液成分： § BSA、Tween20、DTT、明胶----保护酶作用 § Tris.cl提供缓冲作用

 4、影响PCR 产量、质量的因素： §(1)、 Taq酶：常用1U/25µL 浓度低，扩增产物不够； 浓度高，非特异性扩增增加； 酶的活性； §(2)、 dNTP的浓度： 常用100-200µmol/L，不能低于20µmol/L，特异性、保真性；

§(3)、模板：主要考虑纯度及使用量 对纯度要求不高，但含有酚、氯仿等杂质则难以成功。使用量从几个ng到100ng. §(4)、引物浓度： 0.1-0.5µmol/L之间，过多则非特异扩增增加，形成引物二聚体； §(5)、 Mg2+浓度：常用 0.5-2.5mmol/L； 影响：酶的活性、引物-模板退火、特异性

§(6)、 PCR反应程序设定： (1)、变性温度和时间： 要求变性彻底，但要考虑酶的半衰期：92.5℃ （2小时）95℃ （40min）97℃ （5min）94℃变性比较彻底，酶的半衰期也不短。 (2)、引物退火温度Tm与时间； Tm值由引物ATGC数决定每A、T计为2℃， G、C计为4℃，时间一般为40秒到60秒 (3)、 引物延伸温度与时间： 72℃最佳，30-100nt/s，也有用68 ℃如La Taq (4)、循环数： 25-35 cycles 之间，过多则非特异扩增增加；平台效应；

5、PCR例子（Example of reaction solution） 以普通PCR 50l reaction solution 为例) §反应体系配置： 10PCR buffer 25mM MgCl2 dNTP Mixture (10mM each) primer 1 （10 M) primer 2 (10 M) Taq polymerase (5U/ l) DNA template (0.1 g/ l) ddH2O total 5 l (1) 4 l (2mM) 1 l(0.1mM) 1 l(0.2 M) 0.6 l(2U/50 l) 1 l 36.5 l 50 l

Ta: annealing temperature § PCR thermal program 设计的反应程序 相应作用 94C 94 C Tm 72 C 4 C 1min 30sec 5 C endless Heat denaturation Heat denature Primers annealing Extension Last extension Ending reaction 30 cycles 循环数 Ta: annealing temperature

6、PCR的种类 RAPD 特异PCR 锚定PCR RT-PCR 反向PCR 套式PCR 不对称PCR 长程PCR 免疫PCR 锅柄PCR

扩增所用的引物是特异的，扩出的产物也是特定的。 （1）特异PCR 扩增所用的引物是特异的，扩出的产物也是特定的。 F R  （2）RT-PCR： 是一类以mRNA为最初模板的基因的扩增。 A A A A A A A A A A 5`CAP T T T T T T T T T T T

（3）反向PCR： 根据已知序列扩增两侧序列的方法。 此PCR操作过程： 酶切基因组DNA 连接环化目的DNA 未知序列 酶切 引物2 引物1 此PCR操作过程： 酶切基因组DNA 连接环化目的DNA 用引物1和引物2组合扩增出侧翼序列

（4）定量PCR 用途：分析基因组中某个基因的拷贝数或分析基因的转录表达丰度。

概念： 实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log N 原理：通过实时检测PCR每一个循环扩增产物相对应的荧光信号，来实现对起始模板进行定量及定性的分析。初始模板量X0的对数值与C(T) 值之间呈线性关系： log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log N

在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念 —— Ct值。C代表Cycle，t代表threshold Threshold line C(t) value 18.12 +/ - 0.04 阈值线 Ct值

荧光域值（threshold）的设定     PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ´ SDcycle 6-15

Ct值与起始模板的关系     研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 Threshold line C(t) value 18.12 +/ - 0.04 阈值线 Ct值

荧光信号如何产生？ 荧光化学试剂 1、SYBR Green 1 2、Molecular Beacons 3、TaqMan

思考题1 假设通过基因枪轰击技术，获得一株具有抗旱目的性状的转基因水稻，但此转基因水稻出现了株高比非转基因对照水稻变矮的非靶性状。 用PCR相关技术回答下列问题： 1、如何确认此苗是转基因苗？ 2、目的基因是否表达？表达量如何？ 3、株高变矮的可能原因分析。 提示： 转基因时，目的基因是通过T-DNA的整合作用把T-DNA的左右边界和其中间的目的基因和选择标记基因一起整合进受体细胞基因组中。 T-left 标记基因 promoter 目的基因 T- right