生物燃料中嗜酸耐热蛋白的研究 Matthias Hess 刘 健 2009.4.28

前言 由于对全球气候改变和能源依赖问题的关注日益增长，导致更大的投入去减少碳的排放量，开发新的能源。有一个可行的办法，那就是使用从木质纤维素中提取的生物质燃料去代替矿物燃料。

木质纤维素是由纤维素、半纤维素、木质素和少量的可溶性固形物组成。纤维素大分子是由葡萄糖脱水，通过β-1,4葡萄糖苷键连接而成的直链聚合体。在常温下不发生水解，高温下水解也很缓慢。只有在催化剂的作用下，纤维素的水解反应才显著进行。

从木质纤维素中提取生物质燃料的一个主要瓶颈就是高效廉价的能在高温和低ph值下保持活性和稳定的生物催化剂的可获得性（比如，乙醇脱氢酶，纤维素酶和酯酶）。尽管异源基因表达被有效地用来去获得来源于嗜热菌的重组蛋白，但这种嗜酸耐热的蛋白成功的还是很少。

生物催化剂 木质纤维素的降解涉及很多个步骤和一个纤维素降解的化学过程，早在1883年有报道使用高浓度酸降解纤维素。1918年，多了一个用稀酸预处理的步骤，用来促进半纤维素的去除。当前在生物质降解的工业化过程中需要高温和酸性的条件，导致成本高并且低效。

考虑到纤维素降解过程中对酸性高温环境的依赖，可以清晰的看到，在低pH值和高温下保持稳定和活性的酶对生物质燃料有特殊的价值。

当前，一些工业化相关的配糖类水解酶已经从嗜酸耐热的生物体中被识别，其中一些存在于广古菌门、热原体目中嗜酸的生物体，已经涉及到最近对新生物催化剂的研究中。研究的结果识别和表征了几种酶，很可能这些嗜酸耐热的生物催化剂可以使纤维素与生物燃料的工业转化更有效率。 目前，面临的主要挑战是编码酶基因的识别和和构建合适的表达系统。

重组蛋白合成中的障碍 外源基因表达系统的构建是困难的，设计一个能在真核细胞或细菌表达宿主中生产古细菌嗜酸耐热蛋白的表达系统就更具有挑战性，因为有很多因素要考虑。如：蛋白质错误折叠和聚集、酶无活性，甚至完全没有基因表达。这些困难的原因是多方面的，包括mRNA的不稳定、偏爱密码子和缺乏合适的分子伴侣机制。

由大量稀有密码子编码的古细菌蛋白质在大肠杆菌中不善表达，并且它们的表达可能抑制表达宿主的生长。有时这种在外源基因表达中的困难可以通过提供与问题密码子对应的额外tRNA基因拷贝轻易地解决。这样的宿主（大肠杆菌Rosetta（DE3）或大肠杆菌BL21-CodonPlus）已经可以从一些公司获得。

另一个问题是，这些表达菌株没有蛋白酶Lon，因此更容易形成包含体（IBs）。尽管做了大量的努力去避免无效蛋白聚集的形成，但获得可溶性蛋白仍然是一个有待解决的问题。

冷休克反应 当大肠杆菌细胞培养从37度转移至15度时，细胞生长停止，并且产生一套蛋白，定义为冷休克蛋白（CSPs），其中一些CSPs在降温后的蛋白质合成中发挥了重要的作用。在大肠杆菌冷休克反应中一个主要的成员是蛋白CspA，作为一个mRNA的分子伴侣发挥作用。

在CspA基因的上游有一个相当长的5’端非编码区和一个翻译增强子。包含CspA启动子、5’端非编码区、翻译增强子和一个转录终止位点的3’端非编码区在内的质粒被成功的用于温度降低后重组蛋白的高表达。这些质粒称之为pCold载体，可以由Takara生物买到，它很可能是类似的表达载体，将会增加中温生产菌株嗜酸耐热蛋白的产量。

热休克反应 和CSPs相反，热休克蛋白（HSPs ）是暴露在温度升高后合成的蛋白。 HSPs包括分子伴侣、ATP酶、蛋白酶和DNA修复蛋白，它们调节细胞在受到热休克可能致死的条件下的生存，比如温度升高、盐或者乙醇浓度升高，或者pH值降低。

通常情况下，三个主要类别的热休克蛋白（Hsp100、Hsp90和Hsp83）在古细菌中是没有的，而同源的Hsp70（也称为DnaK）、Hsp40（DnaJ）和GrpE在高温和中温古细菌中出现。有人认为，HSPs的减少或许是基因组要求的结果。

表达系统 最近分析了嗜酸耐热广古生菌Picrophilus torridus、嗜酸热原体和Thermoplasma volcanium完整基因组，有趣的是，尽管这些基因组很紧密，但是在这些基因组中还是识别到了DnaK, DnaJ and GrpE的基因编码。尽管超嗜热细菌基因组没有基因编码DnaK 、 DnaJ和GrpE，但是在嗜酸耐热生物体更小的基因组显示开放阅读框来编码这些HSPs的同源蛋白，这样看起来很可能保留这组蛋白是进化的优势，甚至是必要的，对那些在pH值低至0的生物体来说。

这些发现表明，含有DnaK, DnaJ and GrpE的表达载体可以增加来自嗜温菌、嗜热菌，热别是嗜酸耐热菌重组蛋白的产量。 DnaK或dnaK–dnaJ–grpE组的表达对一些在生理条件下来自热原体生物自身蛋白的生产可能是必须的。而且，这些基因在大肠杆菌或其他表达宿主中的联合表达可能是一种简单但是有效的策略，以改善来自嗜酸耐热生物体重组蛋白的活性和稳定性。

除了大肠杆菌，其他像酵母和酿酒酵母、硫化叶菌也具有表达古细菌基因的潜力。研究最好的是硫化菌，大部分关于地热环境中分离出的古细菌的分子生物学和生理学的资料都是从研究硫化菌中获得的。因此，基于部分热原体和DnaK, DnaJ and GrpE簇一个改进的表达系统会是一个理想的表达系统。

结语 构建一个表达系统是一个巨大的挑战，随着高通量测序技术的发展，结合来自宏基因组学、后转录组学和后蛋白质组学的信息，将会进一步改善现有的表达宿主或构建新的表达宿主。

谢谢