单个核细胞分离及 T细胞亚群测定.

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第十四章 免疫细胞的分离及其表面标志检测技术
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医学细胞生物学实验 细胞冻存复苏技术 与细胞计数 徐志浩 遗传与基因工程教研室 院系楼西侧一楼 2016年.
四、标准加入法 (Q=0) 序 号 测定液浓度 c c c 测定液体积 V V V 标液浓度 cS cS cS
第二节 淋巴细胞的检测技术 一.淋巴细胞的分离 (一)外周血单个核细胞(淋巴细胞 > 90%)的分离 密度梯度离心法
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单个核细胞分离及 T细胞亚群测定

外周血单个核细胞分离 密度梯度离心分离法,根据血细胞本身比重的差别来分离各种细胞. 外周血单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞.其比重为1.075--1.090 Ficoll分离液比重为1.077±0.002,主要用于分离外周血单个核细胞.

不同细胞密度不同 人的红细胞密度为1.093 粒细胞密度为1.092 单个核细胞(淋巴细胞和单核细胞)的密度为1.076-1.090

密度梯度离心(Ficoll)离心 

用1.077±0.001的分层液可将细胞分离  

操作步骤 在刻度离心管内装入2mlFicoll分层液,沿管壁加入3-4ml肝素抗凝全血,使其轻轻叠加于分层液上面,离心2000rpm,30min 吸取单个核细胞(白膜层)于干净的刻度玻璃管内,加入Hank‘s液至8ml,重悬后混匀离心,1500rpm,15min,重复洗涤2次 末次离心后去除上清,用含20%小牛血清的Hank’s液调整细胞浓度约2×106左右

注意事项 实验中的细胞得率与室温及分层液比重等有关,室温超过25℃时可影响细胞得率。 加入血液至淋巴细胞分离液时,应保持两层液体的清晰界面。 离心时,启动和停止动作要缓慢。 吸取淋巴细胞时,操作手法要轻、稳、准

各组需领取的器材 肝素抗凝全血标本1份 一次性吸头数根 装有Ficoll的离心管1支(分离用) 空白离心管1支(洗涤用) 用烧杯取50ml Hank’s液 已溶于Hank’s液的小牛血清

花环试验测定外周血T细胞亚群 E花环形成试验是根据人的T细胞表面有绵羊红细胞受体一E受体(E即红细胞erythrocyte),在一定条件下能与绵羊红细胞(SRBC)结合,绵羊红细胞吸附于T细胞周围,形如玫瑰花环,因而得名。此试验既能计数T细胞,又能反映T淋巴细胞活性,从而可以判定机体细胞免疫水平。

原 理 成熟的T淋巴细胞表面表达有CD3/CD4或CD3/CD8抗原,而结合在红细胞上的抗CD3/CD4/CD8单抗可以分别与淋巴细胞表面的CD3/CD4/CD8相结合,通过抗原抗体复合物的桥联作用使得红细胞与T细胞结合形成花环,达到指示效果。

实验步骤 制备OKT溶液:用Hank’s液溶解OKT试剂,将其加入刻度离心管,用Hank’s液将体积加至8ml,离心1500rpm,15min 去除上清,用0.5ml含20%小牛血清的Hank’s液重悬OKT试剂(已制备好) 分别在OKT3,OKT4,OKT8反映管加入40ul相应的OKT单抗和40ul的细胞悬液,冰箱中过夜. 取少量反应液均匀涂于玻片上,自然干燥,用Wright—Giemsa染液染色,加等量的PBS缓冲液,镜下观察染色情况并适时用PBS冲洗后观察湿片. 在显微镜下,淋巴细胞呈蓝色,SRBC红色,一个淋巴细胞周围凡吸附三个或三个以上SRBC即为E花环形成.计数200个淋巴细胞,计算花环形成百分率。

实验结果 E花环形成率(%)= ×100%

E花环示意图 羊红细胞 T淋巴细胞

注意事项 计数及摇匀细胞时动作应轻柔,避免打散已形成的花环 反应管应使用玻璃管,不能用塑料管.

Hank’s液配方-甲液 NaCl 80g KCl 4g MgS04·7H20 1g MgCl2·6H2O 1g CaCl2 1.4g 溶于500ml双蒸水

Hank’s液配方-乙液 Na2HP04·12H20 1.52g KH2P04 0.60g 葡萄糖 10.00g 酚红 0.20g溶解于0.1mol/L NaOH 10ml 双蒸水加至500ml

Hank’s液配方-应用液 取甲液10ml和乙液10ml,加双蒸水至200ml 使用前,用弱碱调整PH为7.2左右

思考题 作E花环实验时为何加入小牛血清? 不用小牛血清用人血清行吗? 加入小牛血清为什么要经56℃30分钟灭活,并用SRBC吸收?

淋巴细胞表面标志检测的临床意义 淋巴细胞表面标志检测是评价免疫功能的重要指标。 对CD4+和CD8+T细胞的测定,有助于免疫缺陷疾病、自身免疫性疾病和移植排斥反应的监测。

临床常见疾病中的T 淋巴细胞的变化