流式细胞术基本原理与应用

主要内容 流式细胞术定义及基本原理 流式细胞仪的基本组成 样本检测及相关应用

Flow Cytometry 什么是流式细胞术？ 在流动状态中测量细胞（颗粒）的各种性状 细胞 测量 流动 ExCyte @ Louisville Augusut 4-5, 2014 什么是流式细胞术？ Flow Cytometry 细胞 测量 流动 在流动状态中测量细胞（颗粒）的各种性状 © Expert Cytometry LLC – 2014 – Do not distribute without permission

流式细胞术定义 概念：流式细胞技术(FCM)是利用流式细胞仪对处于稳定、快速、直线流动状态中颗粒性物质逐一进行多参数、快速的定性、定量分析和分选的技术 临床发展简史：上世纪50年血球计数仪的问世为其雏形，70年代第一台流式细胞仪问世，90年代逐渐开始应用于临床并逐渐得到广泛应用 Laser

流式技术能检测什么样本？ 研究对象:颗粒性物质；既可以是为生物性颗粒，又可以是物理颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等

Tracking Cell proliferation 流式技术能为我们做什么？ 免疫学 Immunology 干细胞 Stem cell 转录因子 Transcription factor 肿瘤学Oncology 磷酸化蛋白PhosphoProtein 血液病学Hematology 细胞免疫表型 Immunophenotyping 特异性mRNA 细胞信号转导 Signal transduction 酶活性 Enzyme activity 细胞凋亡 Apoptosis 细胞生长与死亡 Proliferation Cell Death 细胞功能 Cellular function 离子流 Ion Flux 跟踪细胞增殖 Tracking Cell proliferation 非细胞颗粒 Noncellular particle 膜电位 Membrane potential 细胞周期 Cell Cycle 染色体 chromosome 多指标测量 荧光珠 Beads Array 氧化应激 Oxidative stress 纳米颗粒 Nano particle 线粒体Mitochondrion

流式技术的优势 检测速度快 1000~100000cell/s 以单一细胞为分析基础 多参数测量 具有统计学意义 ExCyte @ Louisville 流式技术的优势 Augusut 4-5, 2014 检测速度快 1000~100000cell/s 以单一细胞为分析基础 多参数测量 具有统计学意义 高分辨率(CV<2%)、高灵敏度(荧光检测灵敏度≤100MESF（Molecules of Equivalent Soluble Fluorochrome），前向角散射光检测灵敏度(0.2∼0.5µm) 可以分选兴趣颗粒，分选纯度高，可达99%以上 © Expert Cytometry LLC – 2014 – Do not distribute without permission

流式技术如何检测颗粒 通过在细胞或者其他颗粒物的表面或者内部标记荧光素而实现流式检测 如细胞内外蛋白表达；DNA含量；生物大分子；细胞器；代谢或生理差异的检测等 细胞膜 细胞器 细胞浆 细胞核 直接标记 直接 打孔 打孔或直接

流式仪器的发展趋势 ExCyte @ Louisville Augusut 4-5, 2014 © Expert Cytometry LLC – 2014 – Do not distribute without permission

流式细胞仪的组件 电路(Electronics) 液流系统(Fluidics) 鞘液与样品悬浮液 细胞流动室的聚焦, 保持稳定干净的液流至关重要 压力差 光路系统(Optics) 光的散射 激光与荧光 光学镜片 光路特性影响实验设计 电路(Electronics) 光子检测器将光子转换为电子 信号放大器 电脉冲信号的生成过程 数据采集,分析 与作图（Data acquisition ,analysis and display) 直方图的生成 一维直方图与二维散点图 高维数据分析

液流系统的功能 将单个细胞准确的运送到交叉点

需要形成层流 管内层流的定义：流体在分层管内流动互不混合，质点与 管轴平行作直线运动，运动速度由与管轴之间的距离决定 雷诺数 ExCyte @ Louisville Augusut 4-5, 2014 需要形成层流 管内层流的定义：流体在分层管内流动互不混合，质点与 管轴平行作直线运动，运动速度由与管轴之间的距离决定 Direction of Flow 流体密度 平均流速 管径 雷诺数 小于2100为层流 流体粘度 © Expert Cytometry LLC – 2014 – Do not distribute without permission

细胞的聚焦 最常用的聚焦方式是流体动 力学聚焦 Hydrodynamic focusing 样本被引入鞘液并处于中心 ExCyte @ Louisville Augusut 4-5, 2014 细胞的聚焦 Typical flow cell 最常用的聚焦方式是流体动 力学聚焦 Hydrodynamic focusing 样本被引入鞘液并处于中心 样本经流体动力学聚焦后细 胞形成单列 鞘液和细胞不混合 Hydrodynamic Focusing Region Cells in single file 新技术：声学聚焦 Acoustic focusing Attune LifeTechnologies © Expert Cytometry LLC – 2014 – Do not distribute without permission

干净的液流 层流

受到干扰的液流 后果 信号强度减弱 信号精确度降低 信号波动增大 污物 气泡 湍流

引入细胞的途径 压力差 容量注射 鞘液流速由气体 或者注射泵决定) 细胞悬浮液和鞘液被 加压 注射泵注入样品 鞘液压力决定液体流 速 鞘液和细胞间的压力 差决定样本流速 不是绝对控制 最常见的方法 容量注射 鞘液流速由气体 或者注射泵决定) 注射泵注入样品 样本流速由注射 泵的速度决定 绝对控制 Cytoflex, Attune, others

液流– 压力差 低压力差 鞘液流速决定液流速度 压差决定核心液流的大小 压力差低 核心液流 核心流更紧凑 更易成单细胞通过 LASER LIGHT

液流– 压力差 高压差 核心流更宽 样本跑的更快 增大信号CV 主要影响线性标度的变量 核心液流 LASER LIGHT

压差对样本的影响 高流速 低流速

流式细胞仪的组件 液流系统(Fluidics) 光路系统(Optics) 电路(Electronics) 鞘液与样品悬浮液 细胞的聚焦, 流动室 保持稳定干净的液流至关重要 压力差 标度 光路系统(Optics) 激光与荧光 光的散射 光学镜片 光路特性影响实验设计 电路(Electronics) 光子检测器将光子转换为电子 信号放大器 电脉冲信号的生成过程 数据采集,分析 与作图（Data acquisition ,analysis and display) 直方图的生成 一维直方图与二维散点图 高维数据分析

激光为什么适于作流式仪器的光源？ 光学谐振腔 方向性好 单色性高 相干性高 强度大大高于其它光源 能量补充 全反射镜 半反射镜 激光 ExCyte @ Louisville Augusut 4-5, 2014 激光为什么适于作流式仪器的光源？ 能量补充 光学谐振腔 全反射镜 半反射镜 激光 实现粒子数反转的激光介质 方向性好 单色性高 相干性高 强度大大高于其它光源 © Expert Cytometry LLC – 2014 – Do not distribute without permission

激光器的种类 常见激光类型 早期 气体激光器 –激光介质是气体 (e.g. 氦－氖激光器HeNe) ExCyte @ Louisville Augusut 4-5, 2014 激光器的种类 常见激光类型 早期 气体激光器 –激光介质是气体 (e.g. 氦－氖激光器HeNe) 固体激光器–激光介质是固体 （红宝石激光器） 染料激光器 –以天然染料为介质 目前 半导体激光器 光纤激光器 © Expert Cytometry LLC – 2014 – Do not distribute without permission

FCM的常用光源和功率 光 源 采用激光光源 提供单一波长、单一方向的稳定光照

光源的布局 共线Co-linear 激光共享同一个光通路lasers share the same optical pathway FC500, Accuri C6 空间分离Spatially separated 激光分开布置Lasers separated 多个交叉点Multiple interrogation points 在激光间必须设置延时（time delay） 目前大部分流式细胞仪

空间分离与激光延迟 Laser 1 Time delay Laser 2 Time delay Laser 3 激光固定 细胞通过交叉点 ExCyte @ Louisville Augusut 4-5, 2014 空间分离与激光延迟 激光固定 细胞通过交叉点 Interrogation point Laser 1 Time delay Laser 2 Time delay Laser 3 © Expert Cytometry LLC – 2014 – Do not distribute without permission

光的特性 散射光 vs. 荧光 散射光：颗粒物经过光 源后的反射光 荧光：颗粒物染的荧光 物经过光激发后发射的 波长与入射光相同 ExCyte @ Louisville Augusut 4-5, 2014 光的特性 散射光 vs. 荧光 散射光：颗粒物经过光 源后的反射光 波长与入射光相同 荧光：颗粒物染的荧光 物经过光激发后发射的 波长与入射光不同 ˝ Expert Cytometry LLC – 2012 – Do not distribute without permission

前向散射光 前向角散射 Forward Scatter(FALS, FSC, FS) 测量角度约为激光方向的~2-20° ExCyte @ Louisville Augusut 4-5, 2014 前向散射光 前向角散射 Forward Scatter(FALS, FSC, FS) 测量角度约为激光方向的~2-20° 主要由颗粒大小决定 与颗粒表面性质有关 死细胞的FSC会减小 挡光板可以防止前向角的光饱和 FSC 检测器 © Expert Cytometry LLC – 2014 – Do not distribute without permission

侧向散射光 衡量垂直于前向角的光 和细胞内部的复杂程度有关 SSC 检测器

前向和侧向散射光的组合可以区分不同形态的细胞群 粒细胞 单核细胞 淋巴细胞

影响散射光的因素 正向散射光 FSC 除细胞大小外还与许多因素有关 侧向散射光 SSC 与凋亡小体的产生有关 ExCyte @ Louisville Augusut 4-5, 2014 影响散射光的因素 正向散射光 FSC 除细胞大小外还与许多因素有关 死细胞Vs活细胞 固定Vs未固定 药物处理Vs未处理 侧向散射光 SSC 与凋亡小体的产生有关 譬如：活细胞和凋亡细胞比起来高FSC，低SSC 活细胞和死细胞 固定前 固定后 © Expert Cytometry LLC – 2014 – Do not distribute without permission

FCM通过荧光标记区分不同的细胞类群

荧光素的种类 荧光蛋白： 出于自然界 合成化合物 (PE)藻红蛋白, (APC)别藻蓝蛋白 GFP, YFP, etc.. 环状化合物 ExCyte @ Louisville Augusut 4-5, 2014 荧光蛋白： 出于自然界 (PE)藻红蛋白, (APC)别藻蓝蛋白 GFP, YFP, etc.. 合成化合物 环状化合物 FITC, Texas Red, Alexa 488 串联染料 Cy5-PE, Cy7-APC 聚合物和纳米晶体染料 BV421, BUV395, Quantum Dots系列 © Expert Cytometry LLC – 2014 – Do not distribute without permission

荧光的特性 激发 Excitation 荧光素经入射光照射 吸收光子后由基态跃迁至激发态 发射 Emission 处于激发态的荧光素分子很不稳定 会在极短时间内返回基态并发出发 射光

图解荧光激发过程 荧光分子吸收光能 普朗克 爱因斯坦关系式 E=hν 热损耗及其它损耗 荧光分子释放能量，回到基态同时释放低能量的长波长光

荧光激发与发射光谱 Excitation curve – 激发光的曲线 Exmax –产生最大激发光的波长 ExCyte @ Louisville Augusut 4-5, 2014 荧光激发与发射光谱 Stokes Shift 495 nm 519 nm Excitation curve – 激发光的曲线 Exmax –产生最大激发光的波长 Emission curve - 发射波光曲线 Emmax –荧光释放的最大发射波长 © Expert Cytometry LLC – 2014 – Do not distribute without permission

滤光片的种类 吸收滤光片 干扰滤光片 染色玻璃 便宜 能发荧光 镜子 由内部干扰而去光 昂贵，易坏 ExCyte @ Louisville Augusut 4-5, 2014 滤光片的种类 吸收滤光片 染色玻璃 便宜 能发荧光 干扰滤光片 镜子 由内部干扰而去光 昂贵，易坏 ˝ Expert Cytometry LLC – 2012 – Do not distribute without permission

长通与带通滤光片 长通滤片(LP) 带通滤片(BP) 通过高于特定波长的光 LP500 通过500及以上的波长 ExCyte @ Louisville Augusut 4-5, 2014 长通与带通滤光片 Long pass filter Band pass filter 505 LP 530/30 PMT 长通滤片(LP) 通过高于特定波长的光 LP500 通过500及以上的波长 带通滤片(BP) 通过特定波长范围Transmits between a given wavelength BP 520/20 可以通过520+/- 10 nm的波长即510到530之间的波长 © Expert Cytometry LLC – 2014 – Do not distribute without permission

了解你的仪器很重要 有几种激光光源？ 有哪些滤光片？ 分色镜 Dichronic mirror exicutes experiments ExCyte @ Louisville Augusut 4-5, 2014 了解你的仪器很重要 有几种激光光源？ 有哪些滤光片？ 分色镜 Dichronic mirror exicutes experiments Laser 带通滤片 Band pass filter FSC Diode © Expert Cytometry LLC – 2014 – Do not distribute without permission

FITC荧光素的激发和发射光谱 Ex 488nm Em 520nm 异硫氰酸荧光素（FITC） 荧光素的使用： 选择正确的激光器；确定正确的滤光片； 确定所需荧光探测器（PMT）

流式常用荧光染料光谱 488nm激光激发的荧光 FITC 520 PE 575 ECD 615 PC5 665 LASER 488 PI violet blue gr een yellow orange red infra- FITC 520 PE 575 ECD 615 PC5 665 LASER 488 PI 620 400-450 l 450-500 l 500-570 l 570-590 l <390 l 590-620 l 620-750 l >750 l PC7 770

线性标度与指数标度 FSC vs SSC 细胞周期 细胞表面和内部蛋白的荧光标记

问题1. 我的抗体是BV605标记，Exmax 405nm Emmax 605nm, 这台仪器能检测吗？ 问题2. 我能用这台仪器同时检测GFP和YFP吗？

课件主题 液流系统(Fluidics) 光路系统(Optics) 电路(Electronics) ExCyte @ Louisville Augusut 4-5, 2014 课件主题 液流系统(Fluidics) 鞘液与样品悬浮液 细胞的聚焦 保持稳定干净的液流至关重要 光路系统(Optics) 光的散射 激光与荧光 光学镜片 光路特性影响实验设计 电路(Electronics) 光子检测器将光子转换为电子 信号放大器 电脉冲信号的生成过程 数据采集,分析 与作图（Data acquisition ,analysis and display) 直方图的生成 一维直方图与二维点阵图 高维数据分析 © Expert Cytometry LLC – 2014 – Do not distribute without permission

光子检测器 光电二极管 (PD) 光电倍增管 Photomultiplier Tube (PMT) 光敏半导体 非高度敏感 对弱信号比较敏感 ExCyte @ Louisville 光子检测器 Augusut 4-5, 2014 光电二极管 (PD) 光敏半导体 非高度敏感 相对便宜 用于强信号, 前向 散射光 光电倍增管 Photomultiplier Tube (PMT) 对弱信号比较敏感 价格昂贵 用于荧光和侧向散射光 © Expert Cytometry LLC – 2014 – Do not distribute without permission

最新技术 雪崩光电二极管 光电倍增管的缺陷 对于波长较长的红色光敏感度较低 不能测量波长800nm以上的红外光 Avalanche Photodiodes （APD) 光电倍增管的缺陷 对于波长较长的红色光敏感度较低 不能测量波长800nm以上的红外光

从光子到数据 PMT 光信号 放大器 信号处理 电压 H A W

从细胞到脉冲信号

课件主题 液流系统(Fluidics) 光路系统(Optics) 电路(Electronics) 鞘液与样品悬浮液 细胞的聚焦 保持稳定干净的液流至关重要 光路系统(Optics) 光的散射 激光与荧光 光学镜片 光路特性影响实验设计 电路(Electronics) 光子检测器将光子转换为电子 信号放大器 电脉冲信号的生成过程 数据采集,分析 与作图（Data acquisition ,analysis and display) 直方图的生成 一维直方图与二维点阵图 高维数据分析

阴性 阳性 Number of events FITC 单变量直方图

单变量直方图与双变量散点图 阴性 单阳性 双阳性

流式数据分析设门

流式细胞术 多参数流式图像和数据 被荧光标记的颗粒物 液流系统(Fluidics) 光路系统(Optics) 电路(Electronics) 数据采集,分析 与作图

流式样本的检测和分析 HIV感染患者CD4阳性T细胞的绝对计数 HIV入侵人体的目标细胞是CD4 T细胞，感染后期能严重破坏T细胞，引起CD4细胞的减少 CD4细胞的计数是诊断、疗效观察和预后的最重要指标 CD4细胞绝对数量如果低于300细胞/ul，需要服药治疗

流式检测在肿瘤性疾病中的意义 病情提示与评价 肿瘤早期：CD4+T细胞减少，NK细胞比例相对明显升高 病情进展：抑制性T细胞（CD8+CD28-T细胞）、调节性T细胞 CD4+CD25+T细胞比例与病情进展正相关 肿瘤及癌前病变：细胞周期及DNA异倍体检测，增殖期细胞>20%提示肿 瘤生长迅速，出现非整数倍体细胞提示预后不良

调节性T细胞分析－CD4+CD25+FOXP3+ 肿瘤细胞能诱导调节性T细胞的产生,调节性T细胞抑制免疫功能 在外周血、骨髓中肿瘤病人的调节性T细胞含量多于正常人群

DNA倍体检测 增殖期细胞（G2/M+S期）>20%提示肿瘤生长迅速， 出现非整数倍体细胞提示预后不良 G0：静止期 G1：DNA合成前期 S：DNA合成期 G2：DNA合成后期 M：有丝分裂期

ANNEXIN V/PI凋亡分析 膜PS外翻 DNA链断裂

线粒体膜电位检测 利用JC-1探针分别检测正常（左）和诱导凋亡（右）的细胞进行线粒体膜电位检测

蛋白磷酸化检测

CFSE跟踪细胞分裂 该方法不是跟踪细胞核的变化，而是胞浆中染料的倍比减少

FL2 (Reporter Parameter) 可溶性细胞因子检测 *Human Th1/Th2 Cytokine I Kit FL2 (Reporter Parameter)

OMIP-025: Evaluation of Human T- and NK-Cell Responses Including Memory and Follicular Helper Phenotype by Intracellular Cytokine Staining （16 color）

三维立方图 Aghaeepour et al, Critical assessment of automated flow cytometry data analysis techniques ， Nature Methods 10, 228–238 (2013)

高维SPADE分析 Qiu et al, Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE, Nature Biotechnology 29, 886–891 (2011)

高维viSNE分析 Amir et al viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia, Nature Biotechnology 31, 545–552 (2013)

流式细胞分选

常见及新型分选仪器 Sony MA900 Beckmen Moflo Astrios Miltenyi MACSQuant Tyto

Questions???