酶联免疫吸附实验(ELISA) －乙肝两对半测定

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1 酶联免疫吸附实验(ELISA) －乙肝两对半测定

2 酶联免疫吸附实验原理 将抗原(或抗体)结合到固相载体上，当加入阳性标本后，相应抗体(或抗原)结合到固相抗原(或抗体)上，利用酶标记的抗抗体(或抗体)可检测出标本中与固相抗原(或抗体)结合的抗体(或抗原)。 间接法、夹心法、竞争法、捕获法

3 乙型肝炎病毒 嗜肝病毒科－双链DNA病毒 三种病毒颗粒 小球型：由HBsAg组成，不含核酸 管型：由小球型连接而成
大球型(Dane颗粒)：完整，有感染性

4 乙肝病毒血清标志物 HBsAg HBsAb 第一个出现，感染后1-2周即可阳性 阳性表示存在HBV感染 出现在HBsAg消失后 保护性抗体
疫苗免疫成功的标志

5 乙肝病毒血清标志物 HBeAg 病毒复制标志 传染性强 HBeAb 传染性降低 长期存在是DNA与肝细胞整合的结果

6 乙肝病毒血清标志物 HBcAg IgM-HBcAb IgG-HBcAb HBV复制的标志 血清中检测不出来 急性HBV感染
急性感染恢复期和慢性持续感染

7 乙肝病毒血清标志物检测原理 血清学标志 原理 包被试剂 标记或结合物 结果判断 HBsAg 夹心法 HBsAb 显色(+) HBeAg
HBeAb 竞争法 HBeAb及中和抗原 不显色(+) HBcAb HBcAg HBcAb-IgM 捕获法 抗人IgM μ链

8 试剂盒组成 包被板 HBsAg－红色 HBsAb－绿色 HBeAg－蓝色 HBeAb－粉红色 HBcAb－橘黄色

9 试剂盒组成 阴性对照和阳性对照 酶标记物(HBeAb测定试剂中含中和抗原) 底物A和底物B 终止液 洗涤浓缩液

10 操作步骤 平衡：将试剂盒各组分从盒中取出，平衡至室温(18-25℃ )。
配洗涤液：充分摇匀浓缩洗涤液(如有晶体应充分溶解)，用蒸馏水或去离子水按1:19稀释。 编号：将微孔条固定于支架，按序编号。

11 操作步骤 加样：分别用加样器在孔中加入阴、阳性对照或待测血清样本50ul (HBcAb测定时待测血清用生理盐水1:30稀释－50ul血清+1.5ml生理盐水)。 加酶：分别在每孔中加入酶标记抗体50ul (HBeAb测定时还要在每孔中加入中和抗原HBeAg50ul)，轻拍混匀。

12 操作步骤 温育：置37℃温育60分钟，室温平衡5分钟。 洗涤：用洗涤液充分洗涤5次，洗涤完后扣干(每次洗涤保持30-60秒的浸泡时间)。
显色：每孔加底物A、B各50ul，轻拍混匀，置37℃避光15分钟。 终止：每孔加终止液50ul，混匀。 观察结果。

13 结果判断 肉眼判定(见前表) 酶标仪判定：用酶标仪单波长450nm或双波长450nm/630nm测定各孔OD值，并根据cut-off值判定结果 OD值>cut-off值为阳性 OD值<cut-off值为阴性

14 注意事项 浓缩洗涤液配制前充分摇匀。 加样本时要加到孔底。 加试剂前应将试剂瓶翻转数次，使液体混匀。 如果滴加，滴加前应弃去1-2滴。

15 注意事项 滴加时瓶身应保持垂直，以使滴量准确。勿将试剂滴在孔壁上。 洗涤时各孔须加满，防止孔口内有游离酶残留。
洗涤时注意孔与孔之间的交叉污染。 脂血，溶血可影响结果。

16 注意事项 所有样本都应按传染源处理。 样品显色深浅与样品中抗体的含量没有一定正相关。任何一种测试都不能绝对保证样品中没有低浓度的抗体存在。
不同品名、不同批号的试剂不可混用，以免产生错误结果。

17 常见模式及临床意义 HBsAg HBsAb HBeAg HBeAb HBcAb 临 床 意 义 + －
临 床 意 义 + － 急性或慢性乙型肝炎感染；提示HBV复制，传染性强－大三阳 急性HBV感染趋向恢复；慢性HBsAg携带者；传染性弱－小三阳 急性HBV感染；慢性HBsAg携带者；传染性弱 慢性HBsAg携带者易转阴；急性HBV感染趋向恢复 急性HBV感染早期或慢性携带者，传染性强 急性HBV感染早期；急性HBV感染潜伏期；慢性HBV携带者，传染性弱

18 常见模式及临床意义 HBsAg HBsAb HBeAg HBeAb HBcAb 临 床 意 义 － + 非典型性或亚临床型HBV感染
临 床 意 义 － + 非典型性或亚临床型HBV感染 注射过乙肝疫苗有免疫力；既往感染；假阳性 急性HBV感染后康复 HBV感染后已恢复 既往感染，仍有免疫力；HBV感染恢复期 既往感染未能测出HBsAb；恢复期HBsAg已消，HBsAb尚未出现；无症状HBsAg携带者 过去和现在未感染过HBV

19 夹心法 样本(含抗体或抗原) 固相抗原或抗体 酶标抗体或抗原

20 竞争法

21 捕获法

22 注意事项 封口膜使用说明： 微孔板拆封后，在取出当天所需的微孔条后，其余微孔条可以封口膜封存以避免受潮。在封存时，注意勿把封口膜粘贴到微孔条底部，以免影响其透光性。 微孔板温育时，以封口膜覆盖孔口，可避免其它因素对实验带来的非预期的影响。