（二）融合蛋白技术的内容 构建融合蛋白的基本原则是， 将第一个蛋白的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白基因，以实现两个基因的共同表达。具体步骤有： 1.进行目的基因的克隆：根据基因序列互补原则 ，设计合适的引物序列，以cDNA为模板，利用PCR技术扩增不同的目的DNA片段。 2.在载体中进行重组：通过限制内切酶将两个DNA片段进行酶切并回收，然后通过连接酶将两个具有相同末端酶切位点的基因片段进行体外连接，并克隆到高表达质粒载体中，构建重组质粒。

Presentation on theme: "（二）融合蛋白技术的内容 构建融合蛋白的基本原则是， 将第一个蛋白的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白基因，以实现两个基因的共同表达。具体步骤有： 1.进行目的基因的克隆：根据基因序列互补原则 ，设计合适的引物序列，以cDNA为模板，利用PCR技术扩增不同的目的DNA片段。 2.在载体中进行重组：通过限制内切酶将两个DNA片段进行酶切并回收，然后通过连接酶将两个具有相同末端酶切位点的基因片段进行体外连接，并克隆到高表达质粒载体中，构建重组质粒。"— Presentation transcript:

1 （二）融合蛋白技术的内容 构建融合蛋白的基本原则是， 将第一个蛋白的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白基因，以实现两个基因的共同表达。具体步骤有： 1.进行目的基因的克隆：根据基因序列互补原则 ，设计合适的引物序列，以cDNA为模板，利用PCR技术扩增不同的目的DNA片段。 2.在载体中进行重组：通过限制内切酶将两个DNA片段进行酶切并回收，然后通过连接酶将两个具有相同末端酶切位点的基因片段进行体外连接，并克隆到高表达质粒载体中，构建重组质粒。

2 （三）融合蛋白技术的关键 3.将重组表达载体转染宿主细胞并利用选择标志进行筛选及测序。 4.融合基因的诱导表达及表达蛋白的纯化 。
在构建融合蛋白中，一个关键的问题是两蛋白间的接头序列( Linker )，即连接肽。它的长度对蛋白质的折叠和稳定性非常重要。如果接头序列太短，可能影响两蛋白高级结构的折叠，从而相互干扰；如果接头序列太长，又涉及免疫原性的问题，因为接头序列本身就是新的抗原。

3 一般来说， 3-5 个氨基酸的Linker 可满足大部分融合蛋白的正确折叠的要求。 有人尝试在融合蛋白间加入一段有疏水性和一定伸展性的较长肽链，如(Gly4Ser1)，目的是将两者分开，以缓解相互干扰作用， 并获得了满意的结果。 但具体涉及到每种蛋白时，需具体分析。当我们构建融合蛋白时，应多选择几种融合方式， 从中优化出理想的连接方式。 另外，大量研究表明连接肽的柔性和疏水性对不扰乱蛋白质的功能结构域是十分重要的。

4 常用的融合蛋白的载体有人血清白蛋白( Huma serum albumin， HSA) 融合蛋白、 β-半乳糖苷酶融合蛋白、 谷胱甘肽 S-转移酶(GST) 融合蛋白以及硫氧还蛋白(Trx) 融合蛋白等。 而人血清白蛋白( HSA) 则由于本身特殊的优点， 更适合于充当长效融合蛋白类 药物的融合载体。 HSA是包含585个氨基酸残基的单链无糖基化的球形蛋白质， 分子量65kD。它是人血浆中含量最高的单一蛋白质(达40g/L)， 在体内有维持血液渗透压， 运输营养和其它重要生物物质的作用。HSA本身是许多内源因子和外源药物的载体。药物和血清白蛋白结合后。可以减少其生物利用度， 增加在体内的半衰期至19d之久。

5 人血清白蛋白融合技术具有明显 的优点，包括：HSA与目标蛋白在胞内经蛋白翻译系统通过肽键连接， 不需额外的体外处理；HSA表达水平较高， 融合后可以提高目的蛋白的表达水平；HSA是一个稳定的“ 惰性” 蛋白， 融合后可以提高目的蛋白的稳定性 ； HAS融合蛋白具有比PEG修饰的蛋白药物更长的半衰期 。

6 （三）细胞因子重组融合蛋白 细胞因子重组融合蛋白是一类利用基因工程的方法将编码细胞因子和其他有特定功能的蛋白分子基因序列连接并表达相应蛋白质融合产物。其结构特点为将细胞因子功能活性域与其他分子的活性域融合，各组分可发挥协同作用，使融合蛋白的生物学活性较各单体大大增强。 按生物学功能的不同可分为：细胞因子与抗体的融合蛋白、细胞因子与毒素的融合蛋白、不同细胞因子的融合蛋白、 细胞因子与细胞因子受体的融合蛋白以及细胞因子与其他分子的融合蛋白。这些兼具特异 性与高效性的新型重组融合蛋白有些已走向临床， 在抗肿瘤、 抗风湿病、抗 HIV感染等领域发挥作用， 为人类疾病的治疗提供新的手段。

7 1、细胞因子与毒素的融合蛋白 在一些肿瘤细胞表面存在许多细胞因子受体， 可利用细胞因子作为靶向载体将细胞毒素运送到肿瘤微环境以杀伤肿瘤细胞。白喉毒素与细胞因子的重组融合蛋白便是这样一类能直接杀伤靶细胞的免疫制剂。

8 2、细胞因子与细胞因 子受体的融合蛋白 通过将在体内发挥作用时相互依赖或者所具有的协同作用细胞因子与细胞因子受体基因重组， 可大大促进其生物学活性的发挥。IL- 6在肝细胞的增殖中起着增强作用。IL-6和IL-6Rα(gp80)的结合使其易于和另一个受体IL-6Rβ (gpl30)结合。

9 体系选择 研究基因功能: 大肠杆菌, 裂殖酵母,昆虫细胞, CHO细胞 多肽药物生产: 大肠杆菌, 毕氏酵母, CHO细胞, 乳腺组织
疫苗: 大肠杆菌, 酵母, 大多数沿用细胞培养产物进行灭毒 单抗生产: 杂交瘤细胞 工业酶生产: 各种微生物

10 大肠杆菌表达载体分类 按蛋白质类型分 按启动子分 单纯表达: pJLA系列, 用NcoI/NdeI导入AUG的载体
融合表达: 融合各种tag, GST, CBD, MAL, GFP, etc 分泌表达: pel/ompT分泌肽 按启动子分 lac及衍生的tac , trc, pac, rac等启动子 IPTG诱导 lamda phage PL和PR 启动子 热诱导 T7 启动子 IPTG诱导 T5 启动子 IPTG诱导 ara启动子 阿拉伯糖诱导

11 常用表达载体 pJLA50X系列; pcDNAII; etc pET系列 (T7 promoter, Novagen公司)
pQE系列 (T5 promoter, Qiagen公司) pMAL系列 (周质表达, BioLabs公司) pGEX系列 (GST融合表达, Pharmacia公司) pBAD系列 (Arabinose诱导型) pTYB系列 (CBD融合, 可以自我切割, BioLabs)

12 各种融合蛋白表达载体 Protein A GST（glutathione S-transferase）
CBD (chitin-binding domain, BioLabs; cellulose-binding domain, Novagen) calmodulin-binding domain, Stratagene) MBP (maltose-binding protein) GFP (green fluorescence protein) Thioredoxin **帮助二硫键形成 Dsb (periplasma enzyme DsbA, DsbC) ** 二硫键的形成与 SUMO (small ubiquitin-related modifier) KSI (ketosteroid isomerase) 基本上全部沉淀 可用亲和层析纯化 帮助可溶化 帮助分泌到周质

13 各种用于抗体识别的标记 His-tag (6-8 Histidine) T7-tag (MASMTGGQQMG)
HSV-tag (QPELAPEDPED) S-tag (KETAAKFERQHMDS) VSV-G-tag (TTDIEMNRLGK) HA-tag (YPYDVPDYA) Flag-tag (DYKDDDDK) Myc-tag (EQKLISEEDL)

14 有前景的特殊用途的tag Biotinylation-tag 未命名 DVEAWLGAR, 被用来和streptoavidin结合
100多AA的结构域, 在大肠杆菌中被识别为生物素化的位点. Promega的PinPointTM Xa-1; Invitrogen的pET104-DEST. 未命名 DVEAWLGAR, 被用来和streptoavidin结合 (个人通讯) 一些病毒外壳蛋白的片段, 破坏细胞膜的结构导致容易进入细胞

15 融合蛋白的专一性切割 DTT: intein的↓Cys 溴化氰: Met↓ Thrombin: LVPR↓GS
Factor Xa: IEGR↓ Enterokinase: DDDDK↓ PreScissionTM protease: LEVLFQ↓GP Genenase I TM PGAAHY↓ TEV protease: ENLYFQ ↓ G

16 特殊的表达用菌株 BL21(DE3)/pLysS : 自身表达T7 RNA polymerase 适用pET系列等带T7启动子的载体
M15/SG13009 : 自身表达T5 RNA polymerase 适用pQE系列等带T5启动子的载体 BL21TrxB(DE3) : thioredoxin reductase 突变 Origami : thioredoxin reductase/glutathione reductase 双突变 适合带thioredoxin reductase的融合表达载体, 帮助形成更多的二硫键 BR21CodonPlusRIL: 富含AT的真核生物基因的表达 BR21CodonPlusRP: 富含GC的真核生物基因的表达

17 重要的原核表达质粒提供商 Novagen Stratagene Invitrogen BioLabs Qiagen Pharmacia
Promega Clontech Roche Gibco/BRL

18 如果所表达的蛋白质有二硫键并需要正确的立体结构, 尽可能进行可溶性表达;
如果所表达的蛋白质没有二硫键或只用来制备抗血清, 采用包含体表达比较好; 如果希望表达的多肽的分子量小于10 kDa, 一定要进行融合表达

19 让表达产物可溶化 采用MBD融合 采用GST融合 采用CBD融合 采用thioredoxin融合 采用Origami等宿主菌
降低菌体培养的速度 温度 (15-30℃), 降低转速

20 让蛋白质分泌到间质去 采用CBD融合 (pET36/37) 采用Dsb融合 (pET39/40) 采用带pelB/ompT引导肽的载体
采用带MBD融合 (pMAL载体, Biolabs) 采用带SUMO融合 (pET SUMO, Invitrogen) 纯化方便: 先用 EDTA/蔗糖 溶液处理, 然后 5 mM MgSO4 洗出

21 包含体来源蛋白质的复性 透析法: 简单; 但费时, 费缓冲液, 蛋白质浓度不能过高(容易产生沉淀)
快速稀释法: 最常用的小规模复性方法; 但比较费时,费缓冲液, 蛋白质的浓度不能高(容易产生沉淀) 超滤透析法: 比较省缓冲液, 处理量大; 但费时, 要控制好蛋白质浓度 凝胶过滤法: 快速, 可重复性高, 不会产生沉淀, 操作复杂一点 亲和层析复性法, 水相二相法, etc

22 经常碰到的问题 表达量不够高； 包含体在8M尿素中不能溶解； 重组蛋白在大肠杆菌中表达的分子量偏小；
带His-tag重组蛋白不吸附到Ni-chelating树脂上； Ni-chelating分离纯化的效果不好； GST融合蛋白不吸附到glutathione-Sepharose上； 包含体来源的采用透析法或稀释法复性时全部沉淀； Ni-chelating错用DTT后发生黑色沉淀该怎么办？ 贵重的亲和层析树脂经常发生结块该怎么办？ 某些表达载体的表达效率在放大培养时无法提高

23 尝试不同表达载体， 特别是N端有融合蛋白的载体
是不是酸性蛋白质？ 是不是蛋白质的合成提前中止了？ （富含Arg, Ile, Leu, Pro这几种氨基酸） 可以尝试用BL21 CodonPlus RIL 或 RP 作宿主菌 (Stratagen)； 使用C端带His-tag的融合表达载体（如pET21, Novagen）以便纯化全长的融合蛋白

24 His-tag被操作过程混入的重金属离子所饱和，可以通过添加0.5 mM EDTA来去除重金属离子的干扰；
其他不明原因导致弱结合 样品没有很好细心去除不溶性物质 重复使用前树脂没有洗干净 蛋白质之间存在相互作用 可以提高盐浓度, 改变pH, 添加2-6 M尿素等方法来洗去杂蛋白质

25 样品没有很好细心去除不溶性物质 重复使用前树脂没有洗干净 蛋白质之间存在相互作用 可以提高盐浓度, 改变pH, 添加2-6 M尿素等方法来洗去杂蛋白质 是不是在进行复性时用了Redox buffer 尝试用 Urea gradient / Gel filtration来解决 尽快用0.1 N HCl冲洗 用0.1 N NaOH / 0.1% SDS洗 主要是溶氧量的问题, 可以通过在摇瓶中加入不同量的培养基的方式来确定最佳体积