实验六 目的基因的PCR扩增.

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1 实验六 目的基因的PCR扩增

2 一、实验目的 通过本实验学习PCR反应的基本原理，掌握PCR的基本操作技术以及琼脂糖凝胶电泳技术。

3 二、实验原理 PCR（polymerase chain reaction) ： 聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增技术。

4 二、实验原理 PCR用于扩增位于两端已知序列之间的DNA区段，即通过引物延伸而进行的重复双向DNA合成。基本原理及过程如下：
（2）引物退火 （3）热稳定DNA聚合酶进行DNA延伸合成。

5 二、实验原理 1、变性：加热使模板DNA在高温下（94-95℃）变性，双 链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。
配对原则互补结合，使引物与模板链3’端结合，形成部分 双链DNA，即退火阶段。 3、延伸：体系反应温度升至中温72℃，耐热DNA聚合酶以单 链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4 种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5’到3’方向复制出互补 DNA，即引物的延伸阶段。

6 5’ 3’ 3’ 5’ 模板 高温变性 低温退火 中温延伸 不断循环 引物对 目的片段 聚 合 酶 链 式 反 应 示 意 图

7 二、实验原理 上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～30个循环后DNA可扩增106～109倍。 典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两条合成的DNA引物、耐热DNA Taq聚合酶。

8 二、实验原理 PCR 的基本反应步骤 变性 95˚C 延伸 72˚C 退火 Tm-5˚C

9 二、实验原理

10 二、实验原理

11 二、实验原理 PCR：变性－退火－延伸

12 二、实验原理 PCR

13 二、实验原理

14 温度（℃） 时间（min） 94 72 60 94℃变性（1min） 60 ℃退火（1min） 72 ℃延伸（1.5min） 循环 循环 循环3 PCR反应的温度循环周期 PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94℃变性1min， 60 ℃退火1min， 72 ℃延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。

15 二、实验原理

16 二、实验原理

17 三、实验仪器与试剂 1 、仪器： PCR 热循环仪、台式离心机、微量移 液器、吸头、电泳设备等。
2 、试剂：10x PCR buffer、dNTPs（25mM）、Taq 酶（5u/μl）、引物1和2( 10 pmol/ul) 、模板DNA、 ddH2O、琼脂 糖、TAE电泳缓冲液、6×上样缓冲 液、溴化乙啶染液、等。

18 四、实验步骤 1、PCR反应一般在200 ul的PCR薄壁管中进行。 2、反应体系（25 µl） ddH2O 18 ul
10x PCR buffer（Mg2+ +） ul 模板DNA ul dNTPs（25mM） ul 引物1 (10 pmol/ul) ul 引物2 (10pmol/ul) ul Taq 酶(5U/l) ul 25 µl

19 四、实验步骤 3、按下述循环程序进行扩增 94℃×3分钟，1个循环 94℃ ×30秒，56℃×30秒，72℃×1分钟，30个循环
72℃ 延伸10 分钟 4℃保温 4、扩增结束后取10μl扩增产物，利用1.2%琼脂糖 电泳检测DNA扩增情况

20 五、实验结果

21 六、PCR反应条件的优化 1、温度、循环参数： （1）变性温度和时间： 保证模板DNA解链完全是保证整个PCR扩增成功的关键。
加热90～95℃，30 ～ 60 s，再复杂的DNA分子也可变性为单链。根据模板DNA复杂程度，可以调整变性温度和时间。一般情况下选择94 ℃ 30 ″，可使各种复杂的DNA分子完全变性。 温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。

22 六、PCR反应条件的优化 （2）复性温度和时间： PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板 的结合。
复性温度的选择，可根据引物的长度和G+C含量确定，长度在15 ～ 25 bp 之间时，复性温度 Tm = 4 (G+C) +2 (A+T) 计算得到，一般位于40 ～ 60℃，30 ～ 60 s。 复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越低，产物特异性越低。 一般情况下选择55 ℃ 30″，足以使引物与模板之间完全结合。

23 六、PCR反应条件的优化 （3）延伸温度和时间： 一般位于Taq酶最适作用温度70 ～ 75 ℃之间。
引物小于16个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引 物与模板的结合，可以缓慢升温到70 ～ 75 ℃。 延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定，< 1Kb，1分钟足够；> 1Kb需加长延伸时间，10Kb片段延伸时间可达15分钟。 延伸时间过长可出现非特异扩增，常用72 ℃ 1′。

24 六、PCR反应条件的优化 （4）循环数： 其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。
循环次数越多，非特异扩增增加。

25 六、PCR反应条件的优化 2、MgCl2浓度： 可显著影响PCR的产量及产物特异性 1.5 ～ 2.0 mM 过高：增加非特异扩增并影响产率
过低：酶活性显著下降。

26 六、PCR反应条件的优化 3、引物： 0.2 ～ 1 μM 偏高：非特异产物扩增及错配，增加引物 之间形成引物二聚体，产量降低。
偏低：产量降低。 引物设计原则： 总原则是提高扩增的效率和特异性

27 七、引物设计原则 ⑴ 长度15～30 b，过短特异性降低，过长则成本增加，产量也下降。
⑵ 引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象，引物 G+C 含量宜在45 ～ 55%左右。 ⑶ 引物内部不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构，两个引物之间尤其在 3’ 末端不应有互补链存在，不然会形成引物二聚体。

28 七、引物设计原则 ⑷ 引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性(<70%)或少于连续8个的互补碱基。要求在引物设计时采用计算机进行辅助检索分析。 ⑸ 引物的 5′ 末端碱基：并没有严格的限制，只要与模板DNA结合的引物长度足够，其 5′ 末端碱基可以不与模板DNA匹配呈游离状态。最多可游离10个碱基并不影响PCR反应进行。

29 七、引物设计原则 ⑹ 引物的 3′ 末端碱基：原则上要求引物的3′末端与模板DNA一定要配对，另外 3′末端的末位碱基在很大程度上影响着 Taq 酶的延伸效率。 引物3′末端碱基在错误配对时不同碱基的引发效率存在很大差异，最好选T、G、C，而不选A。

30 八、注意事项 由于PCR灵敏度非常高，所以应当采取措施以防反应混合物受痕量DNA的污染。
1. 所有与PCR有关的试剂，只作PCR实验用，而不 挪作它用。 2. 操作中所用的PCR管、离心管、吸管头等都只能 一次性使用。 3. 每加一种反应物，应换新的枪头。

31 九、思考题 1、PCR反应液中主要成分是哪些？在PCR反应过 程中各起什么作用？ 2、为什么在PCR反应过程中，使用三个不同的温 度变化？
注意哪些事项？

32 引物的设计的总原则：扩增的效率和特异性 长度：15—30bp 碱基尽可能随机分布（G+C含量 45-55%） 引物内部不能形成二级结构
两引物间不应有互补链存在 3’端一定要与模板严格配对 5’端可引入突变，加酶切位点等 辅助软件：Primer 5，Oligo，DNAsis等 引物Tm：DNA分子一半为单链，另一半为双链时的温度称为该复合体的溶解温度Tm，与G+C含量有关

33 PCR引物设计 AKP CDS 引物 ’GTCGCGGATCCATGTCACGGCCGAGAC 3’ BamH1 CDS 5’AGCTGTCATAAAGATGTCACGGCCGAGACTTATAGTCGCT… …………………………………………………………………………. …… ………………………………………………………………………………. CDS ….CATGAAAGCCGCTCTGGGGCTGAAATAAAACCGCGCCCGG3’ 引物 HindⅢ ’GAGACCCCGACTTTATTTCGAACAGCG 5’

34 扩增条件的优化 优化反应参数：退火温度和时间、变性温度和时间 优化Mg2+浓度 模板的纯度，优化模板浓度 优化dNTP的浓度 优化引物浓度
PCR仪：热盖、升降温速度、精度 PCR管的质量等

35 PCR扩增产物的分析 PCR的应用 PCR扩增产物的回收 琼脂糖凝胶电泳分析 目的基因的获得 基因组克隆 回收的方法很多，主要目
的是去除Taq酶等，取出目 的DNA片段进行后续操作 低熔点琼脂糖法 离心柱过滤 离心柱吸附 玻璃奶吸附 PCR的应用 目的基因的获得 基因组克隆 DNA序列分析 RNA分析 基因突变 基因组的比较研究 医学疾病诊断等