食品卫生细菌的检测技术 第七章.

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1 食品卫生细菌的检测技术 第七章

2 食品卫生细菌的检测技术 第一节 菌落总数的测定 第二节 大肠菌群的测定

3 食品卫生细菌的检测技术 第一节 菌落总数的测定 一、菌落总数的标准平板培养计数法 （一）原理
第一节 菌落总数的测定 一、菌落总数的标准平板培养计数法 （一）原理 平板菌落计数法是通过将样品制成一系列不同的稀释液，使样品中的微生物个体分散成单个细胞状态。再取一定量的稀释度接种，使其均匀分布于培养皿中的培养基上。培养后统计菌落数目，一般认为每个菌落是由一个细菌增殖后形成的，这样就可计算出样品中的含菌数。 （二）仪器用具 冰箱（0～4℃）、恒温培养箱（36℃±1℃）、恒温水浴锅（46℃±1℃）、托盘天平、可调式电炉、高压灭菌锅、吸管、广口瓶或三角瓶（500mL）、玻璃珠（直径为5mm）、平皿（皿底直径为9cm）、试管（18mm×200mm）、试管架、放大镜、菌落计数器、酒精灯、均质器或乳钵、灭菌剪刀、灭菌镊子、75％酒精棉球、玻璃蜡笔、登记簿、不锈钢勺等。

4 食品卫生细菌的检测技术 （三）培养基和试剂 1．营养琼脂培养基
成分: 蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、琼脂15g、蒸馏水1000mL。 制法： 将蛋白胨、牛肉膏、氯化钠溶解于蒸馏水中，加入15%氢氧化钠溶液2mL，校正pH值至7.2～7.4。加入琼脂，加热煮沸，使琼脂溶化。分装烧瓶，121℃高压灭菌15min。 2．磷酸盐缓冲稀释液 （1）储存液 成分： 磷酸二氢钾34g、1mo1/L氢氧化钠175mL、蒸馏水540mL。 制法： 磷酸二氢钾溶解后，用1mo1/L氢氧化钠，调pH值至7.2，再加蒸馏水至1000mL，经121℃，15min高压灭菌后储于冰箱内作为原液备用。

5 食品卫生细菌的检测技术 （2）稀释液 取储存液1.25mL，加蒸馏水至1000mL，分装每瓶100 mL或每管10 mL，经121℃，15min高压灭菌后备用。 3．75％乙醇。 4．无菌生理盐水 取氯化钠8.5g，用1000mL蒸馏水溶解后，分装，高压灭菌。 （四）检验程序 见图7-1。 图7-1 菌落总数平板培养计数法检验程序

6 食品卫生细菌的检测技术 （五）操作步骤 1．检样的稀释 见图7-2
（1）以无菌操作，将检样25g（或25 mL）放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。 固体检样在加人稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000～10000r/min的速度处理lmin，做成1:10的均匀稀释液。 （2）用lmL灭菌吸管吸取1:10稀释液lmL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液），振摇试管混合均匀，做成l:100的稀释液。

7 食品卫生细菌的检测技术 （3）另取lmL灭菌吸管，按上项操作顺序，做10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用1支lmL灭菌吸管。

8 食品卫生细菌的检测技术 图7-2 样品稀释程序

9 食品卫生细菌的检测技术 2．培养 待琼脂凝固后，翻转平皿，置37℃温箱内培养24h（肉、水产品，乳和蛋晶为48h）。 3．菌落计数方法
培养后取出，用肉眼或放大镜检查，记录各平板的菌落数目，求出同稀释度的各平板平均菌落总数。再乘以稀释倍数，即得每克或每毫升样品所含菌落数。 到达规定培养时间，应立即记数。如果不能立即记数，应将平板放置于0～4℃，但不要超过24h。

10 食品卫生细菌的检测技术 4．菌落计数的报告 （1）平板菌落数的选择 选取菌落数在30～300之间的平板作为菌落总数测定标准，一个稀释度使用两个平板的平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，则可计半个平板后乘2以代表全部平皿菌落数。 （2）稀释度的选择 ①应选择平均菌落数在30～300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之（见表7-1例1）。

11 食品卫生细菌的检测技术 ②若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30～300之间，则应视二者之比值来决定，若其比值小于2，应报告其平均数；若大于2，则报告其中较小的数字（表7-1例2及例3）。 ③若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度较高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（表7-1例4）。 ④若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（表7-1例5）。 ⑤若所有稀释度的平均菌落数均无菌生长，则以小于（＜）1乘以最低稀球倍数报告之（表7-1例6）。 ⑥若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（表7-1例7）。

12 食品卫生细菌的检测技术 （3）菌落数的报告 菌落数在100以内时，按其实有数字报告；
菌落数如大于100时，则报告前面两位有效数字，第3位数按四舍五入计算。为了缩短数字后面的零数，也可用10的指数来表示。（见表7-1“报告方式”栏）。

13 食品卫生细菌的检测技术 （六）注意事项 为了正确反映食品中各种需氧菌和兼性厌氧菌存在的情况，检验时必须遵循以下要求和规定：
1．检验中所用玻璃器皿必须彻底清洗干净，不得留有抑菌作用的残留物，并完全灭菌；用作样品稀释的液体，每批都要有空白对照。如果在琼脂对照平板上出现几个菌落时，要追加对照平板，以判定是空白稀释液用于倾注平板的培养基，还是平皿、吸管或空气可能存在的污染。 2．检样的稀释液可用灭菌盐水或蒸馏水。如果对含盐量较高的食品（如酱品等）进行稀释时，则宜采用蒸馏水。 3．营养琼脂底部带有沉淀的部分要弃去。

14 食品卫生细菌的检测技术 4．每递增稀释一次，必须另换一支1mL灭菌吸管，以保证所得检样的稀释倍数准确。吸管在进出装有稀释液的玻璃瓶或试管时，不要触及瓶口及试管口的外侧部分（这些部位可能接触过手或其他污染物），以防感染；在做十倍递增稀释时，吸管插入样液稀释液内不能低于液面2.5cm；吸入液体时应先高于吸管刻度，然后提起吸管尖端离开液面，将尖端贴于玻璃瓶或试管的内壁使吸管内液体调至所要求的刻度，以保证取样的准确，同时在吸管从稀释液内取出时不会有多余的液体粘附于管外。当用吸管将检样稀释液加至另一装有9mL空白稀释液的管内时，应小心沿管壁加入，不要触及管内稀释液，以防吸管尖端外侧部分粘附的检液也混入其中。

15 食品卫生细菌的检测技术 5．为防止细菌增殖及产生片状菌落，在检液加入平皿后，应在20min内倾入琼脂，并立即使其与琼脂混合均匀。检样与琼脂混合时，可将皿底在平面上先前后左右摇动，然后按顺时针方向和逆时针方向旋转，以使充分混匀。混合过程中应加小心，不要使混合物溅到皿边的上方。皿内琼脂凝固后，将平皿翻转，倒置于培养箱进行培养，以避免菌落蔓延生长，防止冷凝水落到培养基表面影响菌落形成。 6．为了控制和了解污染，在取样进行检验的同时，于工作台上打开一块琼脂平板，其暴露的时间，应与该检样从制备、稀释到加入平皿时所暴露的最长的时间相当，然后与加有检样的平皿一并置于温箱内培养，以了解检样在检验操作过程中有无受到来自空气的污染。

16 食品卫生细菌的检测技术 7．培养温度，应根据食品种类而定。肉、乳、蛋类食品用37℃培养，水产品用30℃培养，培养时间为48 h±2h。其他食品，如清凉饮料、调味品、糖果、糕点、果脯、酒类（主要为发酵酒）、豆制品和酱腌菜均系用37℃，24h±2h培养。 培养温度和时间之所以有所不同是因为在制定这些食品卫生标准中关于菌落总数的规定时，分别采用了不同的温度和培养时间所取得的数据之故。水产品因来自淡水或海水，水底温度较低，因而制定水产品细菌方面的卫生标准时，系用30℃作为培养的温度。

17 食品卫生细菌的检测技术 8．加人平皿内的检样稀释液（特别是10-1的稀释液），有时带有食品颗粒，在这种情况下，为了避免与细菌菌落发生混淆，可做一检样稀释液与琼脂混合的平皿，不经培养，而于4℃环境中放置，以便在计数检样菌落时用作对照；如果稀释度大的平板上菌落数反比稀释度小的平板上菌落数高，则系检验工作中发生的差错，属实验事故。此外，也可能因抑菌剂混入样品中所致，均不可用作检样计数报告的依据；如果平板上出现链状菌落，菌落之间没有明显的界限，这是在琼脂与检样混合时，一个细菌块被分散所造成的。进行平板记数时，一条链作为一个菌落计，如有来源不同的几条链，每条链作为一个菌落计，不要把链上生长的各个菌落分开来数。此外，如皿内琼脂凝固后未及时进行培养而遭受昆虫侵入，在昆虫爬过的地方也会出现链状菌落，也不应分开来数。

18 食品卫生细菌的检测技术 9．检样如系微生物类制剂（如酸乳、乳酒），则平板计数中应相应地将有关微生物排除，不可并人检样的菌落总数内做报告。
一般在校正检样的pH至7.6后，再进行稀释和培养，此类嗜酸性微生物往往既不易生长，并可以用革兰氏法染色鉴别。染色鉴别时，要用不校正pH的检样做成相同稀释度的稀释液培养，所生成的菌落涂片染色作对照，以此辨别。 酵母菌卵圆形，远比细菌大，大小为2～5μm×5～3μm，革兰氏阳性着色；乳酸杆菌在24h内，于普通营养琼脂平板上，在有氧条件下培养，通常是不生长的。

19 食品卫生细菌的检测技术 2．CVT琼脂 （1）葡萄糖-胰蛋白胨琼脂
成分： 溴甲酚紫0.04g、胰蛋白胨10g、葡萄糖5g、琼脂15g、蒸馏水1000mL 制法： 将胰蛋白胨溶解于蒸馏水中，校正pH值至6.8～7.0，加入琼脂，加热煮沸，使琼脂溶化，再加入溴甲酚紫和葡萄糖，制成葡萄糖-胰蛋白胨琼脂培养基。 （2）CVT琼脂 成分： 1mg/kg结晶紫或0.5mg/kg四氯唑（TTC）、营养琼脂或葡萄糖-胰蛋白胨琼脂。 制法：于营养琼脂或葡萄糖-胰蛋白胨琼脂内，加入lmg/kg结晶紫或0.5mg/kg氯化三苯四氯唑（TTC），分装烧瓶，121℃15min高压灭菌。

20 食品卫生细菌的检测技术 （三）操作步骤 1．涂布
用无菌吸管吸取冷检样液0.1mL或lmL于表面已十分干燥的TS琼脂或CVT琼脂平板上，继以用无菌L形玻璃棒涂布开来，放置片刻，使水分被琼脂吸入。 2．培养 将平皿倒置于7℃±1℃的冰箱或其他培养设备中培养10天。 3．计数 10天后取出，进行菌落计数。

21 食品卫生细菌的检测技术 三、嗜热菌（芽孢）计数 （一）仪器用具
冰箱、培养箱、高压灭菌锅、恒温水浴锅、托盘天平、可调式电炉、吸管、广口瓶、三角瓶、平皿、试管等。 （二）培养基和试剂 1．葡萄糖-胰蛋白胨琼脂 （同上） 2．亚硫酸盐琼脂 将胰蛋白胨10g、硫酸钠1g、硫乙醇酸钠5g溶解于1000mL蒸馏水中，加入5％柠酸酸铁10mL，加入琼脂，加热煮沸，使琼脂溶化，pH自然。分装烧瓶，121℃高压灭菌20min。 3．去氧肝汤

22 食品卫生细菌的检测技术 （三）操作步骤 将检样25g加入到盛有225mL无菌水的三角烧瓶内，迅速煮沸5min以杀死细菌繁殖体及耐热性低的芽孢，然后将烧瓶浸于冷水中冷却。 1．平酸菌计数 在5只无菌培养皿中各注入2mL样液，用葡萄糖-胰蛋白琼脂做倾注平板，凝固后在50～55℃培养48～72h，计算5个平板上菌落的平均数。 平酸菌在葡萄糖-胰蛋白琼脂平板上的菌落为圆形，直径2～5mm，具不透明的中心及黄色晕，晕很狭，产酸弱的细菌其菌落周围不存在，或不易观察到。平板从培养箱内取出后应立即进行计数，因为黄色会很快消退。如在培养48h后不易辨别是否产酸，则可培养到72h。

23 食品卫生细菌的检测技术 2．不产生硫化氢的嗜热性厌氧菌检验
将已处理过的样品加入等量新制备的去氧肝汤（总量为20mL）于试管中，以2％无菌琼脂封顶，先加热到50～55℃，然后在55℃中培养72h，当有气体生成（琼脂塞破裂，气味似干酪）时，可以认为有嗜热性厌氧菌存在。 3．产生硫化氢的嗜热性厌氧菌计数 将已处理过的样品加入到已熔化的亚硫酸盐琼脂试管中（总量为20mL），共6份。将试管浸于冷水中，培养基固化后，加热到50～55℃，然后在55℃培养48h。能产生硫化氢的细菌会在亚硫酸盐琼脂管内形成特征性的黑小片（因为硫化氢被转化为硫化铁等硫化物）。计算黑小片数目。某些嗜热菌不生成硫化氢，但代之以生成强大还原性氢，使全部培养基变黑色。

24 食品卫生细菌的检测技术 四、厌氧菌计数 （一）仪器用具
冰箱、培养箱、高压灭菌锅、恒温水浴锅、托盘天平、可调式电炉、吸管、广口瓶、三角瓶、平皿、试管等。 （二）培养基和试剂 硫乙醇酸盐琼脂的配制： 将胰消化干酪素15g、L-胱氨酸0.5g、酵母浸膏5g、葡萄糖5g、氯化钠2.5g、硫乙醇酸钠0.5g、刃天青0.001g溶解于1000mL蒸馏水中，加入琼脂15g，加热煮沸，使琼脂溶化。调pH为7.0～7.1，分装烧瓶、试管中，121℃高压灭菌15min。

25 食品卫生细菌的检测技术 （三）操作步骤 1．倾注平板
将检样稀释液lmL，注入于已溶化并晾至45～50℃的硫乙醇酸钠琼脂管内，摇匀，倾注平板。 2．叠一层琼脂 冷凝后，在其上再叠一层3％无菌琼脂。 3．培养、计数 凝固后，在37℃培养96h，然后取出进行菌落计数。

26 食品卫生细菌的检测技术 五、革兰氏阴性菌计数 （一）仪器用具
冰箱、培养箱、高压灭菌锅、恒温水浴锅、托盘天平、可调式电炉、吸管、广口瓶、三角瓶、平皿、试管等。 （二）培养基和试剂 VRB琼脂的制备： 将胰蛋白胨7g、酵母浸膏5g、氯化钠5g、乳糖10g、胆盐1.5 g溶解于1000mL蒸馏水中，加入琼脂15g，加热煮沸，使琼脂溶化，再加入中性红0.03g、结晶紫0.002g，再煮沸2min。pH7.4±0.2 （三）操作步骤 1．制备营养琼脂平板 倾注15～20mL营养琼脂于无菌培养皿中，凝固后，在37℃烘去表面水分。

27 食品卫生细菌的检测技术 2．涂布 吸注检样稀释液0.1mL于平板上，共2份，立即用无菌L形玻棒涂开，放置片刻。 3．层叠VRB琼脂
层叠已溶化并凉到45～50℃的VRB琼脂3～4mL。 4．培养、计数 在30℃培养48h后，计数菌落。

28 食品卫生细菌的检测技术 第二节 大肠菌群的测定 一、乳糖发酵法 （一）原理
第二节 大肠菌群的测定 一、乳糖发酵法 （一）原理 由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，即：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。因此大肠菌群的检测一般都是按照它的定义进行的。 （二）设备和材料 恒温恒湿培养箱（36℃±1℃）、冰箱（0～4℃）、显微镜、天平、高压灭菌锅。恒温水浴（44.5℃±0.5℃）。均质器或乳钵、酒精灯、试管架、平皿（直径为90mm）、试管、吸管、广口瓶或三角烧瓶（500mL）、玻璃珠（直径约5mm）、载玻片、盖玻片等。

29 食品卫生细菌的检测技术 （三）培养基和试剂 1． 乳糖胆盐发酵管
成分： 蛋白胨 20g、胆盐（猪或牛或羊）5g、乳糖10g、0.04%溴甲酚紫水溶液25mL、蒸馏水1000 mL。 制法：将蛋白胨、胆盐、乳糖溶于水中，校正pH7.4，加入指示剂溴甲酚紫，分装于试管，并倒放入一个小试管（杜拉姆发酵管），在121℃高压灭菌15min，备用。 2．伊红美蓝琼脂平板（EMB） 成分： 乳糖10g、蛋白胨10g、磷酸氢二钾2g、琼脂17g、2%伊红Y溶液20mL、0.65%美蓝溶液10mL、蒸馏水1000 mL。 制法： 先将琼脂加到900mL蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾、蛋白胨，混匀，使之溶解。再以蒸馏水补足至1000mL。校正pH值为7.2～7.4，分装于烧瓶内，121℃、15min高压灭菌备用。临用时加入乳糖并加热融化琼脂。冷至60℃左右以无菌手续加入灭菌的指示剂伊红Y溶液和美蓝溶液，摇匀。倾注平皿，备用。

30 食品卫生细菌的检测技术 3． 乳糖发酵管 成分： 蛋白胨20g、乳糖10g、0.04%溴甲酚紫水溶液25mL、蒸馏水1000 mL。
制法： 将蛋白胨、乳糖溶于水中，校正pH7.4，加入指示剂溴甲酚紫，分装于试管，并倒放入一个小试管（杜拉姆发酵管），在121℃高压灭菌15min，备用。 4．EC肉汤 成分： 胰蛋白胨20g、胆盐（3号或混合胆盐）1.5g、乳糖5g、磷酸氢二钾4g、磷酸二氢钾1.5g、氯化钠5g、蒸馏水1000 mL。 制法： 将上述成分混合溶解后，分装在有发酵倒管的试管中，在121℃高压灭菌15min，最终pH为6.9±0.2，备用。

31 食品卫生细菌的检测技术 5．磷酸盐缓冲稀释液 成分： 磷酸二氢钾34g、1mol/L氢氧化钠溶液175 mL、蒸馏水825 mL。
制法： 先将磷酸盐溶解于500 mL蒸馏水中，用1mol/L氢氧化钠溶液校正pH7.2后，再用蒸馏水稀释至1000 mL，制成储存液。 取磷酸盐缓冲储存液1.25 mL，用蒸馏水稀释至1000 mL。分装每瓶100mL或每管10 mL，在121℃高压灭菌15min，备用。 　　6. 生理盐水。

32 食品卫生细菌的检测技术 7.革兰氏染色液 （1）结晶紫染色液 成分： 结晶紫1g、95%乙醇20mL、1%草酸铵水溶液80mL。
制法： 将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。 （2）革兰氏碘液 成分： 碘1g、碘化钾2g、蒸馏水300mL。 制法： 将碘与碘化钾进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300 mL。 （3）沙黄复染液 成分： 沙黄0.25g、95%乙醇10mL、蒸馏水90mL。 制法： 将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。

33 食品卫生细菌的检测技术 8．蛋白胨水（作靛基质试验用） 成分： 蛋白胨（或胰蛋白胨） 20g、氯化钠5g、蒸馏水1000mL。
制法： 将上述成分加热熔化，调pH值为7.0～7.2，分装小试管，高压灭菌121℃、15min。 9．靛基质试剂 柯凡克试剂：将5g对二甲氨基苯甲醛溶解于75mL戊醇中，然后缓慢加入浓盐酸25mL。 试验方法：接种细菌于蛋白胨水中，于44℃培养24h。沿管壁加柯凡克试剂0.3～0.5mL，轻摇试管。阳性者于试剂层显深玫瑰红色。

34 食品卫生细菌的检测技术 （四）大肠菌群检验程序： 见图7-3。 图7-3 大肠菌群乳糖发酵法检验程序

35 食品卫生细菌的检测技术 （五）操作步骤 1．检样稀释
（1）以无菌操作将检样25mL（或g）放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器，以8 000～10000r/min的速度处理1min，做成1:10的均匀稀释液。 （2）用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL，注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混匀，做成1:100的稀释液。 （3）另取1mL灭菌吸管，按上条操作依次做10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌吸管。 （4）根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种3管。

36 食品卫生细菌的检测技术 2．乳糖发酵试验 将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1mL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，1mL及1mL以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管，置36±1℃温箱内，培养24±2h，观察是否产气。如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。 3．分离培养 将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板（EMB）上，置36℃±1℃温箱内，培养18～24h，然后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。

37 食品卫生细菌的检测技术 4．证实试验 在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1～2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置36℃±1℃温箱内培养24 h±2h，观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。 5．结果报告 （1）记录 详细记录试验现象。 （2）报告 根据证实为大肠菌群阳性的管数，查表7-2“大肠菌群最可能数（MPN）检索表”，报告每100mL（g）大肠菌群的MPN值。　　

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39 食品卫生细菌的检测技术

40 食品卫生细菌的检测技术 （六）粪大肠菌群（faecal coliferm）的检验
粪大肠菌群： 指一群能在44℃，24h内发酵乳糖产酸产气和利用色氨酸产生靛基质，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，属大肠埃希氏菌Ⅰ型。 粪大肠菌群的唯一来源是粪便，所以它是粪便污染的确切指标。在被检样品中，如果有粪大肠菌群存在，在大肠菌群检验中也被计入，大肠菌群数实际上就是总大肠菌群数。 一般，大肠菌群和粪大肠菌群数均高，多考虑为近期污染；如果大肠菌群数高，而粪大肠菌群数低，则应着重考虑粪便的远期污染。

41 食品卫生细菌的检测技术 1.检样稀释 （1）以无菌操作将检样25mL（或g）放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器，以8 000～10000r/min的速度处理1min，做成1:10的均匀稀释液。 （2）用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL，注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混匀，做成1:100的稀释液。 （3）另取1mL灭菌吸管，按上条操作依次做10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌吸管。 （4）根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种3管。

42 食品卫生细菌的检测技术 2. 44℃乳糖发酵试验 取10mL 1:10稀释的检样，以无菌操作接种于10mL双料乳糖胆盐发酵管内（1mL及 1mL以下者，用单料管），置44℃±0.5℃水浴内，培养24 h±2h，经培养后，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为阴性。如有产气者，则按下列程序进行。 3. 证实试验 将所有产气发酵管分别划线转种到伊红美蓝琼脂平板（EMB）上，置36℃±1℃温箱内，培养18～24h，同时取该培养液1～2滴接种到蛋白胨水中，置44℃±0.5℃培养24 h±2h。 经培养后取出平板，观察有无典型菌落生长。大肠菌群在伊红美蓝琼脂培养基上的典型菌落呈深紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常具有金属光泽。（也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉紫色，中心较深的菌落。亦常为大肠菌群，均应注意挑选）。 挑取上述可疑菌落，涂片作革兰氏染色镜检。 在蛋白胨水培养液中，加入靛基质试剂约0.5mL，观察靛基质反应。阳性者液面呈玫瑰红色；阴性反应液面呈试剂本色。

43 食品卫生细菌的检测技术 4．结果评定 凡平板上有典型菌落，革兰氏阴性短杆菌，靛基质试验阳性者，则证实为粪大肠菌群阳性，则可报告被检样品中检出粪大肠菌群。 5．结果报告 根据证实为粪大肠菌群阳性管数，查表7-2“大肠菌群最可能数MPN检索表”，报告每100mL（g）粪大肠菌群的最可能数。

44 食品卫生细菌的检测技术 （七）说明 1．MPN检索表
MPN 为最大可能数（Most Probable Number）的简称。这种方法，对样品进行连续系列进行稀释，加入培养基进行培养，从规定的反应呈阳性管数的出现率，用概率论来推算样品中菌数最近似的数值。 MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增加10倍。 2． 初发酵和证实试验 国家标准的三步法，是利用了乳糖发酵管进行了两次发酵试验，为了证实培养物是否符合大肠菌群的定义，即“在37℃分解乳糖产酸产气”。 初发酵阳性管，不能肯定就是大肠菌群细菌，经过证实试验后，有时可能成为阴性。有数据表明，食品中大肠菌群检验步骤的符合率，初发酵与证实试验相差较大。因此，在实际检测工作中，证实试验是必需的。

45 食品卫生细菌的检测技术 3．乳糖发酵试验 乳糖发酵试验使用乳糖胆盐发酵培养基，细菌分解糖类是依靠细菌细胞所产生的各种酶类的作用，细菌产生的分解糖的酶随细菌种类不同而异，可以此鉴别细菌。 大肠杆菌能分解乳糖而产生酸，使培养基的pH降低（指示剂变色）。这一现象可作为观察结果的指标。大肠杆菌细胞在酸性环境中，由于甲酸脱氢酶的作用，可使甲酸分解成C02和H2，在培养基中产生大量气体而进入倒管中，以观察产气。

46 食品卫生细菌的检测技术 产气量与倒管： 在乳糖发酵试验中，经常可以看到在发酵倒管内有极微量的气泡，（有时比小米粒还小），有时可以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡。类似这样的情况能否算产气阴性？一般来说产气量与大肠菌群检出率呈正相关，但产气量小不一定大肠菌群都是阴性，因此应慎重处理。实验表明，大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步试验。

47 食品卫生细菌的检测技术 4．挑选菌落 国家标准方法规定伊红美蓝平板为分离培养基，需要对初发酵阳性培养物接种于伊红美蓝平板分离，对典型和可疑菌落进行观察和证实试验。在该平板上，大肠菌群细菌发酵乳糖产酸，使伊红美蓝结合成黑色化合物，故菌落呈黑紫色，有时还可产生金属光泽。而不发酵乳糖的细菌如沙门氏菌、志贺氏菌等则为无色菌落。 由于大肠菌群是一群细菌的总称，在平板大肠菌群菌落的色泽、形态等方面较大肠菌更为复杂和多样，而且与大肠菌群的检出率密切相关。大肠菌群或粪大肠菌群菌落呈黑紫色有光泽或无光泽时，检出率最高；红色、粉红色菌落检出率较低。

48 食品卫生细菌的检测技术 另外，挑取菌落数与大肠菌群的检出率有密切关系，只挑取一个菌落，由于机率问题，尤其当菌落不典型时，很难避免假阴性的出现。所以挑菌落一定要挑取典型菌落，如无典型菌落则应多挑几个，以免出现假阴性。 5．抑菌剂 大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。抑菌剂的主要作用是抑制其它杂菌，特别是革兰氏阳性菌的生长。 抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌，而有利于大肠菌群细菌的生长和挑选，但对大肠菌群中的某些菌株有时也产生一些抑制作用。有些抑菌剂用量甚微，称量时稍有误差，即可对抑菌作用产生影响，因此抑菌剂的添加应严格按照标准方法进行。 在胆盐用量上，实验表明l％、0.5％和0.25％三个剂量间无何差异，所以本方法采用的胆盐剂量（0.5％）是适宜的，在称量时稍有误差，亦不致影响大肠菌群的检出。

49 食品卫生细菌的检测技术 二、LTSE快速检验法 （一）原理
大肠菌群能分解乳糖，由于具有甲酸解氢酶作用于甲酸，产生氢和二氧化碳气体，因此气体的产生是在产酸的同时进一步分解酸而形成的。根据这个原理，将样品接种到LTSE培养基肉汤内15h。看结果有无产气现象，然后加氧化酶试验和涂片革兰氏染色镜检结果综合判断是否有大肠菌群的存在。 （二）设备与材料 高压蒸汽灭菌锅、干热灭菌箱、恒温箱培养箱、天平、均质器、显微镜、冰箱、接种环、载玻片、试管、童汉氏小管、刻度吸管等。

50 食品卫生细菌的检测技术 （三）培养基和试剂 1．LTSE培养基肉汤（1号） 成分： 乳糖 5g 胰蛋白胨 20g
SDS（十二烷基硫酸钠） g 氯化钠 g 磷酸氢二钠（无水） g 磷酸二氢钾（无水） g 微量元素溶液 mL 蒸馏水 mL pH ±1

51 食品卫生细菌的检测技术 制法：将上述各固体成分加到蒸馏水中，加热溶解，调节pH为7.0±1，冷却后再加微量元素溶液0．5mL，边加边摇匀，分装入有童汉氏小管的试管各5mL。双料成分均加倍，即将上述LTSE肉汤浓缩2倍配制，分装入内有童汉氏小管的试管各10mL（仅分装30mL的供酱油及酱类检验用），置高压蒸汽灭菌器中以115℃灭菌20～30min，贮存于4℃冰箱或阴凉处备用。 2．氧化酶试剂（1％盐酸二甲基对苯二胺） 配制：称取盐酸二甲基对苯二胺0．1g，溶于蒸馏水10mL，于冰箱内避光保存。 3．革兰氏染液 见本章本节一。

52 食品卫生细菌的检测技术 （四）检验程序 大肠菌群LTSE快速检验法检验程序见图7-4。 （五）操作步骤 1．检样稀释
（1）以无菌操作将检样25mL（或25g）放于含有225mL灭菌生理盐水的无菌瓶内，经研磨或充分振摇溶解成为1∶10的均匀稀释液。 固体检样最好用均质器，以8000～10000r/min的速度处理1min做成1∶10的均匀稀释液。 （2）用lmL灭菌吸管吸取1∶10稀释液lmL，注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混匀，做成1∶100的稀释液。 （3）另取lmL灭菌吸管，按上项操作依次10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支lmL灭菌吸管。 （4）根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择3个稀释度，每个稀释度接种3管。

53 食品卫生细菌的检测技术 图7-4 大肠菌群LTSE快速检验法检验程序

54 食品卫生细菌的检测技术 2．预测试验 将待检样品接种于LTSE发酵管内，接种在10mL或10mL以上者，用双料LTSE发酵管，lmL及lmL以下者，用单料LTSE发酵管。预测试验采用9管法，每一稀释度接种3管，置37℃±1℃温箱内，培养15h±1h，观察结果，如有混浊并产气者，即表示为阳性管。对阳性管继续做证实试验。 3．证实试验 （1）菌液涂片 用直径3～4mm的接种环挑取菌液2～3环进行革兰氏染色，镜检。有革兰氏阴性无芽孢杆菌，而杂菌无或者很少。 （2）氧化酶试验 吸取产气管中的培养物约0.5～lmL，滴加氧化酶试剂2～3滴，摇匀，显粉红色或深红色示为氧化酶阳性，不变色或呈试剂的本色为阴性反应。

55 食品卫生细菌的检测技术 （六）结果判断和报告
如有产气，氧化酶阴性、革兰氏阴性的无芽孢杆菌存在，表示大肠菌群阳性，然后查MPN检查表（见表7-2），计算MPN值。 （七）正确使用LTSE检验方法的说明 1．方法的研制与样品考核结果 （1）LTSE法的敏感性与特异性。大肠菌群4个属菌株在LTSE培养基上经37℃，15h出现结果，采用多种常见的非大肠菌群的菌株检测不酵解乳糖产气，经试验证明本法灵敏度高，特异性强，比常规法节约经费82．58%以上。

56 食品卫生细菌的检测技术 （2）LTSE培养基的各种成分都是经过了很多试验反复摸索研制成功的，其营养丰富，抑制杂菌效果强，具有加快目的菌生长发育和促进发酵缓慢的大肠菌群产酸产气的效果。在证实试验中增加了氧化酶试验反应，具有排除非肠道杆菌对乳糖发酵产气的特殊功能。本方法不必加入指示剂，便于做证实试验。 （3）本方法研制成功后，经不同的卫生监测单位实验考核各类食品样品共计703件，结果与常规法总符合率为99.3％；而与美国标准（ANSl）A-1快速法比较,其特异性与敏感性为优。

57 食品卫生细菌的检测技术 2．革兰氏染色的涂片检查说明
本方法加有涂片检查，主要是进一步证实大肠菌群的形态，因本方法的LTSE培养基SDS加的量大，SDS抑制革兰氏阳性菌的效果好且不影响大肠菌群的生长，如果检验人员没有时间，可以省去涂片和镜检这两步，结果其可靠性仍在99％以上。 3．操作注意事项及经验介绍 （1）检样要严格遵守操作规程，避免技术操作的差错。由于大肠菌群是呈分裂繁殖生长，在水中往往具有聚集性及分布不均匀的现象，因此检样前固体和液体样品如同常规法一样，要经过前处理。

58 食品卫生细菌的检测技术 （2）培养基灭菌后，童汉氏小管（小倒管）中应无气泡方能使用；做氧化酶试验的小试管要清洁干净。
（3）本方法灵敏度高，37℃15h培养与常规法符合率基本一致（即99％～100％），超过15h可提高检出率。 （4）初次观察试管法氧化酶试验难以辨别真假阳性结果，可采用氧化酶阳性结果的非肠杆菌科菌株做阳性对照，如绿脓杆菌、脑膜炎双球菌、弧菌科菌株等等。

59 食品卫生细菌的检测技术 三、TTC（氯化三苯四氮唑）显色快速法 （一）培养基 1． TTC乳糖培养基 （1）2％乳糖发酵管
成分： 乳糖20g、蛋白胨20g、蒸馏水1000mL、pH7.4。 制法： 将乳糖、蛋白胨溶解于蒸馏水，调节pH为7.4，分装于含有小倒管的试管中，每管2.5mL，110℃经15min高压灭菌后备用。 （2）TTC培养液 成分： 蛋白胨20g、氯化钠10g、磷酸钠（Na2HPO4·12H2O）10g、十二烷基硫酸钠4g、蒸馏水1000mL、pH7.4。

60 食品卫生细菌的检测技术 制法： 将以上成分加热溶解，调pH7.4，分装于三角瓶，于121℃经15min灭菌后，冷至室温，备用；临用前加入无菌100g/L的无菌TTC水溶液8mL，轻轻摇匀。 （3）分装 以无菌操作，把TTC培养液分装2％乳糖管中，每管加2.5mL，培养后无污染者可使用。 2．三料TTC乳糖培养基 除蒸馏水外，其他成分按TTC乳糖培养基3倍，TTC 2倍，制法同上（加入TTC后培养液稍有云雾状混浊，是正常现象，不影响培养结果）。 （二）检验方法 1．接种 每份样品以无菌操作接种1mL、0.1mL及0.01mL各3管于TTC乳糖培养基中，如接种量为10mL，则用三料TTC乳糖培养基。 2．培养 接种后，置35～37℃温箱培养18～24h。

61 食品卫生细菌的检测技术 （三）结果判断 观察TTC乳糖培养液有无产红色及产气，结果判定如表7-3。 表7-3 显色法大肠菌群结果判断

62 食品卫生细菌的检测技术 四、DC（去氧胆酸钠）半固体试管快速法 （四）结果报告 根据阳性管数，查表7-2“大肠菌群最可能数MPN检索表”。
（一）培养基 1．成分 蛋白胨 g 氯化钠 g 乳糖 lg K2HPO4·3H g 柠檬酸铁铵 g 10％去氧胆酸钠水溶液 lmL 0.4％BTB mL 安氏指示剂 mL 琼脂粉（或琼脂条0.8g） g 蒸馏水 lOOmL pH

63 食品卫生细菌的检测技术 2．制法 将以上固体成分加热溶解于水，调整pH7.2，随即加入二组指示剂与10％去氧胆酸钠水溶液，最后煮沸3min备用。 （二）检验方法 1．样品处理 各类样品的处理与接种量均按国标方法要求进行。 2．接种 （1）流体样品 吸取原液3个lmL，分别注入3个灭菌试管内，再吸取1∶10和1∶100稀释样品各3个lmL，分别加入灭菌试管内，每管lmL。

64 食品卫生细菌的检测技术 接种lmL样品的试管，注入已溶化并冷至50℃左右DC半固体培养基3mL。接种10mL样品的试管加入3倍DC培养基5mL，立即将样品与培养基充分混合。 （3）培养 待凝固后，置37℃温箱内培养18～24h，取出观察结果。 （三）结果判定 （1）培养基变橘红色，有气泡产生或琼脂崩裂，记录为“+ +”。 （2）培养基为橘红色，或有橘红色菌落无气泡和琼脂崩裂现象，记录为“+”。 （3）培养基为绿色，有黄色菌落无气泡和琼脂崩裂现象，记录为“土”。 （4）培养基为绿色，记录为“一”。

65 食品卫生细菌的检测技术 （四） 结果报告 1．根据结果判定为（1）、（4）反应结果，记录阳性管数，直接查表7-2“大肠菌群最可能数MPN检索表”，报告之。 2．如遇（2）、（3）反应结果，可挑2～3个可疑大肠菌群菌落，接种乳糖复发酵管，置37℃温箱培养18～24h，根据产酸产气管数，查表7-2 “大肠菌群最可能数MPN检索表”，报告之。

66 食品卫生细菌的检测技术 五、纸片快速检验法 （一）材料 1．培养基 成分 蛋白胨（优质胨） 1g 三号胆盐 0．1 乳糖 1．5g
三号胆盐 ．1 乳糖 ．5g 磷酸钾K2HPO4·3H2O ．4g 1.6％溴甲酚紫溶液 ．5mL 琼脂粉 ．1g 蒸馏水 mL 4％TTC溶液 ．5mL 氯化钠 ．5g pH ．0～7．2

67 食品卫生细菌的检测技术 制法 上述成分除溴甲酚紫和TTC外，其他成分加热溶解，冷却后调pH7.0～7.2，再按量加入溴甲酚紫溶液，混匀。
于116℃，灭菌15min，冷却至60℃左右，按量加入TTC溶液，混匀，即可浸渍纸片，然后用无菌镊子将纸片排放于消毒的大搪瓷盘内，放入40℃左右恒温室或37℃温箱烘干。将烘干的纸片经无菌操作装入消毒的塑料袋内，包装好放冰箱保存备用。 2．纸片制备和塑料袋 将新华中速定性滤纸，切成10cm～12cm，叠成5cm×6cm大小的双层纸片，经干烤或高压灭菌（高压后于37℃恒温箱烘干）后备用。 塑料袋为耐高温的聚丙塑料薄膜袋。按实验要求压合成一定规格的袋，于116℃，经15min灭菌后备用。

68 食品卫生细菌的检测技术 （二）检验方法 1．样品处理 液体样品按国标方法进行；固体样品，取25g样品，研碎加25mL灭菌盐水混匀。 2．接种
液体样品吸取3个lmL分别涂布于3张纸片，再吸取1∶10和l∶100稀释液各3个lmL，分别涂布于3张纸片；固体样品，吸取1:1混悬液3个lmL分别涂布于3张纸片，再吸取1∶10和1∶100稀释液各3个lmL，分别涂布于3张纸片，而后用手轻轻压平，置（36土1）℃恒温箱，培养15h观察结果。

69 食品卫生细菌的检测技术 （三）结果判定 （1）纸片上出现紫红色菌落，其周围有黄圈者为阳性。 （2）纸片为一种颜色，无菌落生长者为阴性。
（3）纸片呈紫色，有紫红色菌落，其周围无黄圈者为阴性。 （4）酸性食品接种后，纸片变黄，经培养后无紫红色菌落为阴性。 （5）纸片变色呈现不典型菌落，结果可疑者应做复发酵进行验证。 （四）结果报告 根据纸片的阳性片数，查表7-2“大肠菌群最可能数MPN检索表”，报告之。