5、利用EST数据库发现新基因 EST (expressed sequence tags),是从基因表达的短的序列，携带着完整基因某些片断的信息，称为表达序列标签 获得一个EST的途径有三种：1 大规模测序；2 比较同源性；3 差异显示或基因芯片法获得与某一性状相关的EST 电脑克隆 第一步，找到与待克隆基因相关的EST；第二步.

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1 5、利用EST数据库发现新基因 EST (expressed sequence tags),是从基因表达的短的序列，携带着完整基因某些片断的信息，称为表达序列标签 获得一个EST的途径有三种：1 大规模测序；2 比较同源性；3 差异显示或基因芯片法获得与某一性状相关的EST 电脑克隆 第一步，找到与待克隆基因相关的EST；第二步 计算机拼接、比较；第三步 检测潜在的可读框ORF确定是否为全长

2 6. SAGE Serial analysis of gene expression Isolate SAGE tags
AAAAA AAAAA AAAAA 6. SAGE AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA Isolate SAGE tags Link tags together and sequence Quantify Tags and Determine Patterns of Gene Expression Serial analysis of gene expression (SAGE) is a method for comprehensive analysis of gene expression patterns Three principles underlie the SAGE methodology: 1) A short sequence tag (10-14bp) contains sufficient information to uniquely identify a transcript provided that that the tag is obtained from a unique position within each transcript; 2) Sequence tags can be linked together to from long serial molecules that can be cloned and sequenced; and 3) Quantification of the number of times a particular tag is observed provides the expression level of the corresponding transcript. Sample A Sample B Expression Level Gene Products

3 SAGE Serial analysis of gene expression (SAGE) is a method for comprehensive analysis of gene expression patterns Three principles underlie the SAGE methodology: 1) A short sequence tag (10-14bp) contains sufficient information to uniquely identify a transcript provided that that the tag is obtained from a unique position within each transcript; 2) Sequence tags can be linked together to from long serial molecules that can be cloned and sequenced; and 3) Quantification of the number of times a particular tag is observed provides the expression level of the corresponding transcript.

4 7.基因芯片（gene chip）技术 基本概念
生物芯片（Biochip）:是指通过机器人自动印迹或引导光化学合成技术在硅片、玻璃、凝胶或尼龙膜上制造的生物分子微列阵，根据分子间的特异性相互作用的原理，将生命科学领域中不连续的分析过程集成于芯片表面，以实现对细胞、蛋白、基因及其他生物组份的准确、快速、大信息量的检测。 基因芯片（Gene chip, DNA chip, or DNA microarry）：生物芯片的一种。它是将DNA分子固定于支持物上，并与标记的样品杂交，通过自动化仪器检测杂交信号的强度来判断样品中靶分子的数量，进而得知样品中mRNA的表达量，也可进行基因突变体的检测和基因序列的测定，为进一步了解基因间的相互关系及基因克隆提供有用的工具 特定的方法在特定的基质上制造的分子微点阵，利用分子间的特异性相互作用原理，将不连续的分析过程集成于芯片表面。 GeneChip将探针固定在特定的固体基质上，而原来印记在膜上的目标DNA或RNA进行标记，然后进行的大规模的杂交。 4

5 Affymetrix的原位合成技术可制作的点阵密度高达106~1010/cm2。
The chips are manufactured on wafers. These wafers are 5-inch-by-5-inch pieces of glass. You can get anywhere from 49 to 900 individual chips out of each wafer, depending on the overall size of the final chip to be made A standard chip is 1.28 cm X 1.28 cm, the size of a thumbnail On each one of those chips there are now over 6.5 million sections (squares) known as features In each feature there are millions of identical DNA probes on them In the diagram above, the probes are represented by the blue spiral connected to the feature A probes is a 25 base pair (25-mer) length piece of DNA that is attached to the chip Each feature has millions of identical probes attached to them The probes are used to “probe” the sample for certain DNA or RNA segments The orange spirals with the stars at the end are RNA from a sample applied to the chip Probes are the essential part of how the GeneChip functions and how you can use these chips to identify if a gene is on or off 25mer长度的寡核苷酸的信号强度和分辨率达到了一个平衡，在这个长度下，有一个碱基发生错配，杂交复合物就会变得很不稳定。如果长度达到60mer，就无法区分序列上十分接近的序列了。 Affymetrix的原位合成技术可制作的点阵密度高达106~1010/cm2。 5

6 Cy3和Cy5 Cy3激发波长532nm Cy5激发波长635nm

7 表达谱芯片实验流程 1.Samples 2.mRNA Extraction and Reverse Transcription
3.Fluorescent Labeling of cDNA’s 4.Hybridization to a DNA Microarray 5.Scanning the Hybridized Array 6.Interpreting the Scanned Image

8 Liu et al., JXB, 2009

9 8. RNA-seq 技术

10 Xu et al., BMC Genomics, 2009

11 9. 酵母双杂交技术(Yeast Two-hybrid System)
1、酵母双元杂交系统的应用 • 验证传统方法检测的相互作用的蛋白 • 蛋白的功能作图 – 功能域 /氨基酸 • 鉴别新的相互作用蛋白 (from a cDNA library)

12 Gal4双元系统 原理 GAL4 蛋白来源于酵母，真核生物基因转录需要反式转录因子参与，含有两个不同的结构域,DNA结合结构域，识别Gal4基因上游激活序列，核定位序列，转录激活结构域 • Gal4 protein comprises DNA binding domains(BD) and activating domains (AD) • Binding domain interact with promoter • Activating domain with transcription machinery 12

13 背景知识 两种酵母融合。 13

14 酵母双杂交技术原理示意图

15 Yeast two-hybrid system 实例
Wu et al. Cell. 2006, 125:

16 BiFC ： 双分子荧光互补 bimolecular fluorescence complementation
2002年，Hu等报道的一种直观、快速地判断目标蛋白在活细胞中的定位和相互作用的新技术 BiFC技术原理将荧光蛋白在某些特定的位点切开，形成不发荧光的N和C端2个多肽，称为N片段(N-fragment)和C片段(C-fragment)。 当这2个荧光蛋白的片段分别连接到1组有相互作用的目标蛋白上，在细胞内共表达或体外混合这2个融合蛋白时，由于目标蛋白质的相互作用，荧光蛋白的2个片段在空间上互相靠近互补，重新组装成完整的发光蛋白。 这2个片段在细胞内共表达或体外混合时，不能自发地组装成完整的荧光蛋白，在该荧光蛋白的激发光激发时不能产生荧光。 16

17 Yuan et al. Plant Cell 2010,22:

18 免疫共沉淀（co-immunoprecipitation）
优点： （1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态； （2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响； （3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。 缺点： （1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用； （2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用； （3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。

19 酵母单杂交技术 HIS3：筛选标记 Li等（1993）从酵母双杂交技术发展而来，研究DNA和蛋白质互作。
酵母单杂交技术最早是1993年由Li et al [1,2]从酵母双杂交技术发展而来，酵母双杂交技术通过对报告基因的 表型进行检测以实现对蛋白质间相互作用的研究[3-6]，而酵母单杂交技术则通过对报告基因的表型检测，分 析DNA、蛋白之间的相互作用，以研究真核细胞内的基因表达调控。 HIS3：筛选标记 Li等（1993）从酵母双杂交技术发展而来，研究DNA和蛋白质互作。 19

20 染色质免疫共沉淀 ChIP: Chromatin immuno precipitation
主要实验流程：在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并通过超声或酶处理将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过抗原抗体的特异性识别反应沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片段的纯化与检测，获得蛋白质与DNA相互作用的信息。 研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用可以用染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay, CHIP），一般有两种情况，一是需要了解某特异的DNA结合蛋白所结合的DNA序列时，用特异性抗体免疫沉淀染色质中该蛋白结合的DNA片段，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，例如检测体内反式因子与DNA的动态作用。二是需要了解DNA甲基化谱时用识别CpG甲基化结合蛋白(MBDs)的抗体免疫沉淀染色质中含有CpG甲基化的DNA片段，了解DNA甲基化的位点。需要注意的是染色质免疫沉淀技术以全基因组为对象，后续一般也需要高通量技术，例如甲基化芯片。 20

21 DNA和蛋白质在甲醛的作用下相互交联 21

22 思考题 什么是基因工程？ 对社会和科学技术发展有什么重要意义？ 限制性内切酶有哪几类？什么是回文结构？常见载体？报告基因？蓝白斑筛选？
基因克隆的常用策略及原理？果树上使用的有哪些方法？ 什么是细菌感受态？转化？转染？酵母双杂交？

23 主要参考资料 基因 VIII 基因操作原理 孙明 华中农业大学 植物基因工程 王关林 方宏均 科学出版社 2002
Molecular Cloning 分子克隆实验指南（E3,2001） Principles of Gene Manipulation (S Primrose, R Twyman, Blackwell scientific publication)