第三章 细胞工程基本技术.

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1 第三章 细胞工程基本技术

2 实验室 无菌技术 显微技术 细胞冻存与复苏 细胞的分离、观察与分析

3 一、实验室 1. 基本组成： 准备室 无菌间 操作间 培养室 分析室

4 2.主要设备： 包括 水处理设备（纯水系统）、无菌设备（灭菌锅、超净工作台等）、培养设备（培养箱）、分离观察设备（离心机、显微镜）、保存设备（超低温冰箱、液氮罐等）

5 二、无菌技术 在细胞培养过程中，操作环境、试验器皿、试剂等要经过灭菌处理，确保无污染。 包括：培养用品的清洗、灭菌

6 培养用品的清洗：玻璃器皿、胶塞、塑料制品
灭菌： 细菌、真菌、支原体、病毒污染是细胞培养的最大危险。

7 常用灭菌方法： 物理灭菌 化学灭菌：最常用70%乙醇；皮肤、台面等 抗生素灭菌：抑制细菌、真菌等污染。 紫外线灭菌：空气、操作台等；
湿热灭菌：培养液、玻璃器皿、手术器械等； 过滤除菌：含血清的培养液。 化学灭菌：最常用70%乙醇；皮肤、台面等 抗生素灭菌：抑制细菌、真菌等污染。

8 污染检测与控制： 细菌：培养液颜色发黄，变混浊，显微镜下可见大量圆球状颗粒漂浮。

9 真菌：常见有黑曲霉、酵母菌、烟曲霉等 培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。抗真菌剂可预防（两性霉素B）。 丝状菌污染 

10 支原体污染：直径在0.2µm以下，难以通过过滤除去。（可采用地衣红染色或荧光染色进行判断）

11 病毒：大小以纳米计，可以通过滤器。潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题。
交叉污染

12 三、显微技术 常用光学显微镜、相差显微镜、倒置显微镜、荧光显微镜等

13 四、细胞的冻存与复苏 细胞在传代过程中许多生物学性状容易发生改变，如细胞的粘附性、染色体数目等； 对有限增殖细胞系来说，传代次数是有限的； 过多的传代增加污染机会； 消耗大量人力物力。 细胞冻存与复苏

14 冻存： 低温液氮冻存 ：－196℃ 在细胞冻存过程中需要添加冷冻保护液。 常用低温保护剂： 甘油（10%）或 二甲基亚砜（7.5%—10%）
原则：慢冻 细胞内外环境中的水容易形成冰晶，一方面对细胞膜造成机械损伤，另一方面未结冰的细胞内的渗透压急剧升高，造成细胞脱水、pH值改变，蛋白质会发生变性等，最终使细胞死亡。

15 复苏： 按照一定复温速度将细胞悬液由冻存状态恢复到常温。 原则：快融（1-2分钟内即恢复到常温）

16 冻存过程： ①分装冻存小管； ②冻存小管放人普通冰箱冷藏层(4～8℃)，40min； ③置于普通冰箱冷冻层(-10～-20℃)，30～60min； ④ -30℃放置30min左右； ⑤在-70～-80℃下过夜； ⑥最后将冻存小管投入液氮保存。

17 注意事项： 常温下DMSO对人体有毒，故在配制冷冻保护剂时最好带手套。 冻存管投入液氮时，动作要小心、轻巧，以避免液氮从液氮罐内溅出。 应注意控制冻存细胞的质量。 勿将冻存的细胞长时间放置在0～-60℃范围内。

18 ②从液氮中取出冻存小管，立即投入水浴锅中快速晃动，使其在1～2min完全融解；
复苏过程： ①将恒温水浴锅的温度调至37～40℃； ②从液氮中取出冻存小管，立即投入水浴锅中快速晃动，使其在1～2min完全融解； ③将细胞冻存悬液移入离心管，加入约5m1培养液，轻轻吹匀； ④将细胞悬液经离心5min。弃上清液； ⑤给细胞沉淀物加入完全培养液，轻轻吹吸均匀； ⑥将细胞悬液移入培养瓶内，加足培养液进行培养。

19 五、细胞观察与分析 细胞计数：采用血细胞计数法，结果以每毫升细胞数来表示。可采用结晶紫染色 细胞活力：总细胞中活细胞所占的百分比。常用方法为台盼蓝染色法

20 注意： 1，压线的细胞记上不记下、记左不记右 2，抱团的细胞记成一个 3，抱团的细胞超过10%需重新打散后再记
细胞密度（个/ml）＝（4个大格细胞总数/4）×104（10的4次方） ×稀释倍数

21 细胞固定：把组织和细胞的原有结构尽可能完整地保存下来。
使细胞的各部分易于着色，适于观察和长期保存。 不同固定剂对细胞的不同成分、结构固定效果不同。 选择合适的固定液是达到固定目的的基础。

22 常用固定剂： 甲醇/醋酸：浓度为3:1，适用于观察染色体和Giemsa染色。 FAA固定液（40%福尔马林5ml+冰醋酸5ml+80%乙醇90ml）：可用作固定植物的一般组织。 卡诺氏（乙醇60ml+氯仿30ml+冰醋酸10ml）：适用于显示细胞化学成分。

23 细胞染色： 苏木精-伊红染色：同时染细胞核与细胞质； Giemsa染色：将细胞核染成紫红色，细胞质染成粉红色； 福尔根染色：细胞核粉红至紫红色，细胞质无色； 考马斯亮蓝染色：显示细胞骨架； 荧光染色

24 Giemsa染色 苏木精-伊红染色 福尔根染色

25 考马斯亮蓝染色 荧光显微镜下的大肠杆菌

26 总结