Proteomics: the global analysis of proteins

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1 Proteomics: the global analysis of proteins
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3 SDS polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE gel)
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4 Western blotting can detect the specificity protein
detect one protein in a mixture of any number of proteins.

5 Method (1) Proteins are separated by gel electrophoresis

6 (2) The proteins are transferred to membrane (nitrocellulose or PVDF)

7 Western blotimg 7

8 (3)blocking (4)add primary antibody (5)add labeled secondary antibody (enzyme .Fluorophore….)

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11 Gold nanoparticels ?

12 two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis
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17 Sanger’s法(Sanger’s method) 1945年
蛋白質或胜肽的胺基末端決定方法 51 residues 100g >10 years

18 Edman切割法(Edman degradation)
可能是目前蛋白質序列分析中，最重要的技術 蛋白質胜肽定序儀(Protein peptide sequenator) 自動化分析蛋白質的序列

19 Mass spectrometry matrix-assisted laser desorption-ionization (MALDI) and time-of-flight (TOF)
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20 MALDI-TOF matrix-assisted laser desorption inoization- time of flight
MS本身有三個主要部份 第一個部份是來源（source），由樣品產生離子；第二個部份是質析（mass analyzer），依離子質量/價數【mass/charge（m/z）】的比例分開它們；第三個部份是偵測（detector），也就是mass analyzer的結果。

21 MALDI-TOF matrix-assisted laser desorption inoization- time of flight
將待測物peptides與matrix混合，matrix中的微小分子，會吸收特殊波長的光。source這兒提供雷射光，matrix吸收光子而激發電子，釋放的能量轉到sample中的peptide上，離開matrix表面進入空氣中。這樣的離子化過程，依樣品的性質，產生正離子或負離子，正離子的產生是在脫離matrix的過程中，接受了質子所致。每一個peptide分子會接受單一的質子，因此，大部份的peptide離子都會帶一個正電。在MALDI形成這樣的離子後，再送入TOF mass analyzer分析。

22 MALDI-TOF matrix-assisted laser desorption inoization- time of flight
TOF（time of flight），能測得離子由analyzer一端到另一端（detector）的時間，m/z值愈大，時間愈短。MS的優劣是在於能區別離子間微小m/z的差異，但是這種測量直線行進速度的TOF解析力不夠高，造成直線型TOF低解析力的原因，在於相同m/z值的離子，直線行進速度也有快慢之別。

23 MALDI-TOF MS 優點 第一，操作簡便，是所有MS中最容易學會的一種，可以在一天之內分析上百件樣品。
第二，需要大量製備蛋白質樣品的地方，目前從2D 電泳膠體的製作、蛋白質點（protein spots）的取出及酵素水解，都採用自動化的設備，MALDI-TOP也能以這樣的形式存在，減少人力、提高效率。 第三，隨著TOF分析方式的改良，得到的蛋白質體數據也愈正確。 第四，MALDI-TOF MS的靈敏度高，可以偵測到少量的（可到10-18 mole）蛋白質。

24 MALDI-TOF MS 缺點 第一，MALDI-TOF MS可以提供正確的「質量（mass）」資訊，卻不能獲得詳細的「序列（sequence data）」結果。 第二，分析的成敗，幾乎取決於樣品製備的品質，如果樣品在水解過程被金屬、鹽類、尿素、丙醇污染，或是界面活性劑（detergen）沒有去除乾淨，都會使樣品在MALDI source的電離（ionization）受到極大的影響。MALDI-TOF MS對此特別敏感。

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30 檢測流程 LCM (Laser Capture Microdissection)

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