核酸扩增检测方法类卫生检疫行业标准验证程序简介

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1 核酸扩增检测方法类卫生检疫行业标准验证程序简介
广东出入境检验检疫局 郑夔

2 内容概要 一、背景 二、为什么制订此程序 三、适用范围 四、谁来执行 五、如何执行 六、验证指标 七、流程图

3 一、背景 1、满足认监委对标准的管理要求，同时，也是与 国际接轨。
2、为了规范标准中方法类的验证过程，保证标准 方法的科学性、准确性与可适用性。 3、进一步提升方法类标准的制定质量，保证检得 准。

4 二、为什么制订此程序 方法类行业标准的验证是指通过试验确证，并提供 有效证据以证明符合具体方法应用的特定要求。为 规范核酸扩增检测方法类卫生检疫行业标准的验证 流程，提高本专业检测类方法的科学性、严谨性和 适用性，特制定本程序。

5 三、适用范围 本程序适用于核酸扩增检测方法类卫生检疫行业标准制（修） 订的过程中方法的验证，核酸扩增检测技术泛指以扩增DNA 或RNA为手段，从而检测特定核酸序列或筛查特定基因的检 测技术，主要包括： 聚合酶链反应（PCR）、 实时荧光聚合酶链反应（Real time PCR）、 依赖核酸序列的扩增技术（NASBA）、 环介导等温扩增技术（LAMP）、 连接酶链反应（LCR）、 转录依赖的扩增反应（TMA）等。 无论该标准是新制定标准、由现有方法转化的标准或由原标 准修订后的标准。此外，实验室采用非标准方法及自主研究 开发新方法时,也可参照本程序用以判断这些方法的适用性。

6 四、谁来执行 卫生检疫专业标准化技术委员会（以下简称“委员 会”）负责本专业检测方法验证的组织、审核等管 理工作。委员会通过秘书处执行具体职责，包括审 核验证实验室资质，建立并定期更新维护验证实验 室数据库，指定并组织验证实验室开展验证，组织 专家进行验证材料的审核及验证数据的分析等。

7 五、如何执行 实验室内验证 是指在标准制定方实验室中，于合理的时间间隔内， 在不同条件下，通过对相同或不同的验证样本进行 检测分析，对同一方法的性能指标进行确证的过程。 用于初步判断方法的适用性。 独立实验室验证 独立于标准制定方的实验室内验证。用于复核方法 的性能指标是否能够满足预期的分析目的。

8 实验室内验证 （1） 标准制定方完成方法草案、 选择合适的验证 参数 （即方法的性能指标） 、并设计实验室内验 证方案。
（2）标准制定方根据所选验证参数完成实验室内 验证，并向秘书处提交验证材料。验证材料应包括 方法草案、验证方案、实验室内验证报告。 （3）秘书处组织专家审核实验室内验证材料的完 整性与符合性。

9 独立实验室验证 （4）实验室内验证材料审核通过后，秘书处组织独立 于制定方的验证实验室，通过重复测试验证参数（即方 法的性能指标）进行独立实验室验证。 （5）视不同情况选择1家以上独立实验室进行验证： 制（修）订的方法标准属于国内创新的，进行验证的实 验室应当不少于2家；等同采纳国际方法标准的，由标 准制定方或者其他1家实验室进行验证；修改采用国际 方法标准的，进行验证的实验室不少于1家。 （6）验证实验室完成独立实验室验证后，提交结果至 秘书处。 （7）秘书处组织专家审核独立实验室验证结果，并将 验证结果反馈给标准制定方。

10 六、验证指标 1、特异性试验 特异性是指检测方法只检测被检测对象的能力。检测一定数 量的不含被检测对象的样本，结果应为阴性；检测可能引起 非特异反应的样本，如与被检测对象种属相近、感染部位相 同或感染症状相似的其他样本，结果应为阴性。 2、灵敏性试验 用已知的阳性样本进行试验。可采用对阳性样本进行系列稀 释的方式确定最低检出限量，并与已知样本结果得出的结果 进行比较，根据符合率确定方法的灵敏性。 3、重复性试验 用至少高、低2个浓度水平的阳性对照样本各进行10次重复 测定，计算变异系数（CV，%），方法重复性的合格指标应 为（CV，%）≤5% 。

11 六、验证指标 4、亚型检测能力 方法的被检测对象可能有多种血清型或基因亚型，标准 制定方规定方法的检测范围如无特殊说明，应能检出所 有包含当前国内外常见的亚型样本。如未能获得更多的 亚型样本，则应根据方法中提供的引物、探针等寡核苷 酸序列进行理论上的验证。 5、干扰试验 人体或媒介动物的血液、组织、排泄物等样本可能含干 扰核酸扩增检测的物质，如脂血样本、血液样本的 EDTA 抗凝剂、粪便样本中的复杂成份等。标准制定方 应对方法的检测样本范围作相应的规定，验证试验时可 将至少高、低2个浓度水平的阳性对照样本加入相应的 含干扰成份阴性样本中，按拟定的方法进行干扰试验。

12 七、流程图