第十四章 核酸类药物 第一节 核酸类物质的分离提取及其发酵生产 一、 RNA 与 DNA 的提取与制备 （一） RNA 的提取与制备 1. 工业用 RNA 的提取 （ 1 ） RNA 及其工业来源 通常在细菌中 RNA 占 5 ％ -25 ％，在酵母中占 2.7 ％～ 15 ％， 在霉菌中占 0.7%~28%, 面包酵母含 RNA4.1 ％～ 7.2 ％。 培养酵母菌体收率高，易于提取 RNA ，在工业上主要由 RNA 生产 5’ －核苷酸。

（ 2 ）高 RNA 含量酵母菌株的筛选 可以从自然界筛选到 RNA 含量高的酵母菌株，也可以 用诱变育种的方法提高酵母菌的 RNA 含量。

糖蜜水 糖蜜配料液 水解 水解液 中和 中和沉淀 过滤 清糖水 种子 揺瓶发酵 种子培养物 种子发酵 种子发酵培养物 连续发酵 发酵液 收集菌体 酵母菌体 酵母浆 保温抽提 配料 抽提液 分离 抽提清液 酸化 酸化液 过滤 RNA 洗涤干燥 RNA 干粉 磨粉包装 成品 水洗涤 发酵法生产高含量 RNA 酵母及其 RNA 提取工艺流程

（ 3 ）用工业废水培养高含量 RNA 酵母 减少环境污染，降低粮食消耗 （ 4 ） RNA 的提取实例 啤酒酵母是提取 RNA 的很好的资源。 取 100g 压榨啤酒酵母（含水 70 ％ ），加入 230ml 含 NaOH 3g 的水， 20 ℃以下搅拌 30min 。用 6mol/L HCl 调至 pH7 ，搅拌 15 分钟，离心得上清液 255ml 。冷至 10 ℃以下， 6mol/L HCl 调 pH2.5 ，置冷过夜，离心等 RNA1.8g （纯度 80 ％）。

（二） DNA 的提取与制备 1. 工业用 DNA 的提取 取新鲜冷冻鱼精 20kg ，用绞肉机粉碎 2 次成浆，加入等体积水，搅拌 均匀，倾入反应锅内，缓慢搅拌，升温至 100 ℃，保温 15 分钟， 迅速冷却至 20 ～ 25 ℃，离心去除鱼精蛋白等沉淀物，共获得 35L 含热变性 DNA 溶液。加乙醇沉淀，可得到固体 DNA 产品。 2. 具有生物活性 DNA 的制备 动物内脏加 4 倍量生理盐水经组织捣碎机捣碎 1 分钟，匀浆于 2500rpm 离心 30 分钟，沉淀用同样体积的生理盐水洗涤 3 次，每 次洗涤后离心，将沉淀悬浮于 20 倍量的冷生理盐水中，再捣碎 3 分钟，加入 2 倍量 5 ％十二烷基磺酸钠，并搅拌 2 ～ 3 小时，在 0 ℃ 2500rpm 离心，在上层液中加入等体积的冷乙醇，离心即可得 纤维状 DNA ，再用冷乙醇和丙酮洗涤，减压低温干燥得粗品 DNA 。

二、用酶解法、发酵法和半合成法制备核苷酸 （一）酶解法及碱水解法制备核苷酸 1. 酶解法制备脱氧核苷酸

桔青霉或熄曲霉 液体培养 2 天 发酵液 压滤除菌体 酶液 酶解液 鱼精 绞肉机粉碎 鱼精匀浆 热变性 冷却，过滤 DNA 溶液 加热使酶失活，调 pH9.0 置冷过夜，过滤 DNA 降解液 吸附于氯型阴离子交换树脂分步洗脱 脱氧胞苷酸 dCMP 脱氧腺苷 dAMP 脱氧胸苷酸 dTMP 脱氧鸟苷酸 dGMP 混合，调 pH 保温

2. 酶解法制备戊糖核苷酸 桔青霉 M843 培养 产生核酸酶 P1 酵母提取 RNA RNA 降解成 5‘ －核苷酸 阳离子树脂分离 无离子水洗涤 UMP 浑浊液 除盐等杂质 UMP UMP 稀溶液 UMP 干粉 GMP ， CMP 混和液 GMP 浓溶液 GMP 干粉 CMP 稀溶液 GMP 浓溶液 GMP 干粉 AMP 稀溶液 AMP 浓溶液 AMP 干粉 流出液 pH1.5 CMP 溶液 2.0~3.53.5~ ~4.5 碳柱吸附，解析 阴离子树脂 乙醇沉淀 阴离子树脂 乙醇沉淀 减压浓缩

3. 双酶法生产肌苷酸和鸟苷酸（ I ＋ G ） 呈味核苷酸 桔青霉 M843 培养 产生核酸酶 P1 曲霉 M1197 培养 产生 AMP 脱氨霉 RNA 降解， AMP 脱氨 RNA 溶解，调 pH 升温 阳树脂分离（ I ＋ G ） 减压浓缩 乙醇结晶 干燥 产品（ I ＋ G ）

4. 菌体自溶法生产核苷酸 谷氨酸发酵液 离心 湿菌体 自溶 pH10 菌体自溶液 除盐 无盐提取液 离心 清液 pH3.5 阴阳离子交换树脂 单核苷酸纯化液 浓缩 浓缩液 结晶 结晶单核苷酸

5. 碱水解法生产 2‘ ， 3’ －混合核苷酸 RNA 中的磷酸二酯键对碱性条件不稳定的特性，很容 易生成 2‘ ， 3’ －环状磷酸酯，水解生成 2‘ ， 3’ －核苷酸。 取 RNA 配成 3 ％～ 3.5 ％的水溶液，加氢氧化钠达 0.3mol/L 浓度，升温 38C ，保温 小时，用 6mol/L 盐酸中和至 pH7.0 ，从 RNA 水解成 2‘ ， 3’ －核苷酸降解 率达 95 ％以上。 （二）发酵法生产核苷酸 1. 发酵法生产肌苷酸（ IMP ） 肌苷酸钠是一种高效增鲜剂，在谷氨酸钠中添加 2 ％，鲜 度可以增加 3 倍。 2. 发酵法生产黄苷酸（ XMP ）及酶法转化成鸟苷酸 （三）半合成法制备核苷酸

三、核苷的制备 （一） RNA 化学水解法制备核苷 （二）发酵法生产核苷 1. 发酵法生产肌苷 2. 发酵法生产鸟苷和黄苷 3. 发酵法生产腺苷

第二节 核酸类药物 核酸类药物可分为两类：一类为具有天然结构的核酸类 物质，有助于改善机体的物质代谢和能量平衡，加速 受损组织的修复，促进缺氧组织恢复正常生理机能。 临床上用于放射病，血小板减少症，急慢性肝炎，心 血管疾病，肌肉萎缩等代谢障碍。如肌苷， ATP ，辅 酶 A ，脱氧核苷酸，肌苷酸等 第二类为自然结构碱基、核苷、核苷酸结构的类似物或 聚合物，这一类核酸类药物是当今治疗病毒，肿瘤， 艾滋病得重要手段，也是产生干扰素、免疫抑制的临 床药物。已经正式在临床应用的 8 个抗病毒核苷酸类药 物。

一、叠氮胸苷（ AZT ） （一）结构与性质 AZT 治疗艾滋病的新药。化学名为 3‘ －叠氮－ 2’ －脱氧胸腺嘧啶核苷，商品名为 Refrovir 。 68 ％的病人临床表现为减轻症状，延长寿命的 显著效果，常见副作用为贫血，白血球减少， 部分病人骨髓坏死等。 AZT 的药理作用是在体内经磷酸化后生成了 3‘ －叠氮－ 2’ －脱氧胸腺嘧啶核苷酸，取代了正 常的胸腺嘧啶核苷酸参与病毒 DNA 的合成，含 有 AZT 成分 DNA 不能继续复制，从而达到阻止病 毒增殖的目的。 （二）生产工艺

二、阿糖腺苷 （一）结构与性质 阿糖腺苷的化学名称为 9 － β － D －阿拉伯呋喃糖腺嘌 呤。 阿糖腺苷是近年来引人注目的广谱 DNA 病毒抑制剂， 对单纯疱疹ⅠⅡ型，带状疱疹，巨细，牛痘等 DNA 病毒， 在体内外都有明显抑制作用。 阿糖腺苷在体内受激酶作用生成阿糖腺三磷，是脱氧 腺三磷（ dATP ）的拮抗物，从而抑制了以 dATP 为底 物的病毒 DNA 聚合酶的活力。 （二）生产工艺

三、三氮唑核苷（ Ribavirin ，利巴伟林） （一）结构与性质 三氮唑核苷商品名病毒唑，对 DNA 病毒， RNA 病毒都 具有广泛作用。 三氮唑核苷除了主要应用于小儿呼吸系统的疾病治疗 以外，已用于猩红热，流感以及爱滋病的治疗，特别 是在临床上能明显改善患者症状，而且毒副作用比 AZT 小，药物价格与 AZT 相差 50 倍。 在体内被磷酸化成三氮唑核苷酸，抑制肌苷酸脱氧酶 阻断鸟苷酸的生物合成，从而抑制病毒 DNA 合成。 （二）生产工艺