几种水产动物血涂片的 制作及形态比较观察

一、实验目的 了解血涂片的制作方法， 同时认识鲫鱼和美国牛蛙的血细胞。

二、实验内容 鲫鱼和美国牛蛙血涂片的制作

三、实验材料 1. 鲫鱼，美国牛蛙 2. Giemsa 染料粉剂、瑞氏染料粉剂、 甘油、甲 醇 3. 磷酸二氢钾（无水）、磷酸氢二钠（无水） 4. 载玻片、 盖玻片、 注射器、玻璃棒、 pH 试纸、 烧杯、容量瓶

Giemsa 氏染料原液配制 Giemsa 染料粉剂 0.75g 甘油 50ml 甲醇 50ml 将粉剂放于甘油内搅匀，放入 60 度温箱 24h ， 经常摇匀。取出待冷再加甲醇混匀，配成原液， 密封棕色瓶保存。使用时，以原液 5ml 加 M/15 磷酸盐缓冲液（ pH ） 50ml 稀释成工作 液。

磷酸缓冲液的配置 分别称取磷酸二氢钾（无水） 6.64g ，磷酸氢二 钠（无水） 2.56g ，加少量水溶解，加水至 1000ml 。用精密 pH 试纸确定其 pH 。

载玻片的准备 新载玻片常带有游离碱质，须用浓度为 lmol/L 的 HCl 浸泡 24h ，再用清水彻底冲洗， 干燥后备用。旧载玻片要用含洗涤剂的清水中 煮沸 20min ，洗掉血膜，再用清水反复冲洗， 最后用 0.95mol/L 乙醇浸泡 1h ，干燥备用。使 用载玻片时，不要用手触及玻片表面，保持玻 片清洁、干燥、中性、无油腻。

四、实验步骤 1. 血涂片的制作 2. 染色 3. 观察

血涂片制作方法 取血液标本一滴置载玻片的一端，以边缘平滑 的推片一端，从血滴前沿方向接触血液，使血 液沿推片散开，推片与载玻片保持 30 ～ 45 度 夹角，平稳地向前推动，血液即在载玻片上形 成薄层血膜

涂片的厚薄与血滴大小、推片与载玻片之间的 角度、推片时的速度及血细胞比容有关。血滴 大、角度大、速度快则血膜越厚；反之则血膜 越薄。 一张良好的血涂片，要求厚薄适宜，头体尾明 显，细胞分布均匀，血膜边缘整齐并留有的空 隙。

血涂片的染色 血涂片染色包括两个过程：固定和染色。固定 是将细胞蛋白质和多糖等成分迅速交联凝固， 以保持细胞原有形态结构不发生变化。 常用的染色方法有瑞士染色法 (Wright) 、姬姆 萨染色法 (Giemsa) 等。

瑞氏染液 0.1g 瑞氏染料粉剂放入洁净干燥的研钵中，滴加 60ml 甲醇至全溶，密封于棕色小口瓶内，放置 半个月 -1 个月。

步 骤步 骤 血涂片经甲醇固定 2min 滴加工作液染色 15-30min ，室温。 蒸馏水漂洗 缓冲液分色，至血膜显示淡红色。 标本干燥后，封片活不封片 观察

结果 红细胞被染成橘红色，白细胞核紫色，嗜 酸性颗粒鲜红色，嗜碱性颗粒蓝紫色，中性颗 粒紫或紫红色，淋巴及单核细胞胞浆蓝灰色。

压片法 分别取鲫鱼和美国牛蛙的肝脏、肾脏、脾脏组 织，然后压片在载玻片上，晾干，然后染色。

染色注意事项 1 ．载玻片必须非常洁净，中性，无油脂。不清 洁或非中性的载玻片会造成细胞特别是红细胞 形态发生改变，导致假性的异常形态红细胞出 现。非中性的载玻片还会影响染色环境的 pH 值，带油脂的载玻片会使细胞分布不均匀。

2. 染色过深、过浅的处理。染色过深、过浅与血涂片 中细胞数量、血膜厚度、染色时间、染液浓度、 pH 值密切相关。对于重要的标本可采用先试染的方法， 根据试染效果调节第二次染色方式。纠正染色过深可 缩短染色时间或稀释染液。纠正染色过浅可延长染色 时间。如果标本片有限出现了染色过深、过浅的情况， 可用如下办法挽救：染色过深可加少量缓冲液覆盖血 膜部分褪色，在显微镜下观察褪色情况及时终止。染 色过浅可重加染色液和缓冲液复染，也要在显微镜下 观察及时终止。

血液的组成 血液 血浆 血浆 血 C 血 C 红 C 白 C 血小板 水（ 90% ） 其它

圆形细胞 人血涂片 (Giemsa 染色 ) ( 红色箭头示白细胞，兰色箭头示红细胞 )

白 C (leukocytes, white blood cell, WBC) WBC 有粒 C 无粒 C 中性粒 C 嗜酸性粒 C 嗜碱性粒 C 淋巴 C 单核 C 分类依据：根据 C 质内有无特殊颗 粒和颗粒的嗜色性。

中性粒 C 数量： % ，是数量最多的白 C 。 数量： % ，是数量最多的白 C 。 结构：分叶状（ 2-5 个核）。 结构：分叶状（ 2-5 个核）。 核左移： 1-2 叶核增多 - 细菌感染。 核右移： 4-5 叶核增多 -- 衰老。

中性粒 C Neutrophilic granulocyte

(2) 嗜酸性粒 C ( Eosinophils ) 数量： 0.5-3%. 数量： 0.5-3%. C 核： “ 八 ” 字形核. C 核： “ 八 ” 字形核. C 质：粗大嗜酸性颗粒 - 溶酶体. C 质：粗大嗜酸性颗粒 - 溶酶体. EM ：颗粒中有长方形晶体. EM ：颗粒中有长方形晶体.

嗜酸性粒 C( LM ) Eosinophilic granulocyte

(3) 嗜碱性粒 C 数量：最少， 0-1%. 数量：最少， 0-1%. C 核：不规则, 多呈 “S” 形. C 核：不规则, 多呈 “S” 形. C 质：蓝紫色颗粒, 大小不等, 分布不均. C 质：蓝紫色颗粒, 大小不等, 分布不均.

嗜碱性粒 CLM Basophilic granulocyte

(4) 淋巴 C ( Lymphocytes) 数量： 25-30%. 数量： 25-30%. C 核：大，圆形, 常有浅凹, 染色质浓密呈粗 块状. C 核：大，圆形, 常有浅凹, 染色质浓密呈粗 块状. C 质：少, 嗜碱性. C 质：少, 嗜碱性.

淋巴 C （ LM ） Lymphocyte

(5) 单核 C ( Monocytes) 数量： 3-8%. 数量： 3-8%. 大小：血液中最大的 C. 大小：血液中最大的 C. C 核：肾形, 马蹄形, 着色较浅. C 核：肾形, 马蹄形, 着色较浅. C 质：丰富, 弱嗜碱性, 灰兰色. C 质：丰富, 弱嗜碱性, 灰兰色.

单核 C Monocyte

血小板 Blood platelet

结 果结 果 红细胞橘红色，白细胞核紫色，嗜酸性粒细胞 鲜红色，嗜碱性粒细胞蓝紫色，中性颗粒紫或 紫红色，淋巴细胞及单核细胞细胞质蓝灰色， 血小板紫色。

蛙血液涂片

细胞形态和显微测量实验内容 细胞的显微测量需要以目镜测微 尺来进行，但其分度值随着放大倍 数的变化而变化，长度也不一样， 因此需要事先进行标定。而镜台测 微尺的长度是已知的，目镜测微尺 的标定是通过镜台测微尺来进行的。 细胞的显微测量

0.01mm 目镜测微尺 ( 长度随放大倍数发生改变 ) 镜台测微尺 ( 每一大刻度值为 0.1mm ，小刻度值为 0.01mm) 目镜测微尺与镜台测微尺

放镜台测微尺于载物台 调节使镜台测微尺 与目镜测微尺平行 取下镜台测微尺 * 装入目镜测微尺 记录二者在重合线之间的刻度 计算标定值 目镜测微尺的标定

如在低倍镜下重合线之间目镜测微尺的长度为 50 格 镜台测微尺的长度为 68 格 则： 50:68=1:x x=1.36 格，即目镜测微尺的 1 小格相当于镜台测微尺 的 1.36 格，而镜台测微尺每 1 小格的长度为 10um ，则目镜测微 尺每 1 小格的长度为 13.6um 。 标定时 应注意 的问题 标定时必须严格按照操作规程，以免损坏测微尺； 重合线的判断应在二者刻度线完全重合； 比例式的计算； 标定值只能在同一放大倍数下进行测量。

如何进行蛙细胞的显微测量？ 目镜测微尺 短轴长轴 转动目镜镜筒

细胞膜 细胞质 细胞核 蛙红细胞示意图

五、实验作业 一张好的血涂片的要求是什么 ? 绘制鲫鱼和牛蛙的血细胞。