实验六 发育生物学常用 研究方法之三： Western blot
实验目的 通过 Western blot 技术，研究特定蛋白在 不同发育阶段的果蝇体内表达情况，从而 推测该蛋白的功能。 通过 Western blot 技术，研究特定蛋白在 不同发育阶段的果蝇体内表达情况，从而 推测该蛋白的功能。
实验内容 1 转膜； 1 转膜； 2 封闭及抗体孵育等。 2 封闭及抗体孵育等。
作业 Western blot 图片及分析 Western blot 图片及分析
A液A液 B液B液 C液C液 浸 A 液滤纸 浸 B 液滤纸 浸 C 液滤纸 浸 C 液的 gel 浸 C 液的硝酸纤维素膜（正面朝上） ㈠ ㈩转膜： 各层滤纸之间不能有气泡，滤纸、膜、胶一样大小，对齐放置，膜 要做好标记。 电转移时间一般为 1h 左右。 转膜结束后用 ddH 2 O 漂洗一下膜，再用丽春红染色，否则可能染 不上色；成像。
免疫印迹： 膜在 1%~5% 脱脂奶粉（ TBS 配）中，摇 1h 膜在 1%~5% 脱脂奶粉（ TBS 配）中，摇 1h Ⅰ抗 1 ： 100~1 ： 500 稀释于封闭液中，摇 2h 或 4 ℃过夜 Ⅰ抗 1 ： 100~1 ： 500 稀释于封闭液中，摇 2h 或 4 ℃过夜 TBST （ TBS+0.02%Tween ）洗 3×10min TBST （ TBS+0.02%Tween ）洗 3×10min Ⅱ抗（辣根酶标记山羊抗兔 IgG ） 1 ： 稀释，摇 1~2h Ⅱ抗（辣根酶标记山羊抗兔 IgG ） 1 ： 稀释，摇 1~2h TBST 洗膜 3×10min TBST 洗膜 3×10min TBS 洗膜 1×10min TBS 洗膜 1×10min 发色： 发色： 1ml 4 氯 -1- 萘酚（ 6mg/ml ） 1ml 4 氯 -1- 萘酚（ 6mg/ml ） 9ml TBS 黑暗处发色 5~30min 9ml TBS 黑暗处发色 5~30min 6ul H 2 O 2 6ul H 2 O 2 终止，成像 终止，成像 需要注意的是，最后发出 的条带颜色深浅与Ⅰ抗, Ⅱ抗的量以及膜在其中浸 的时间长短有关