崔巍 中国医学科学院北京协和医院

分子检验与疾病 预防、早期发现、有效治疗 疗效监测 治疗方案 选择 诊断 早期风险评 估 / 筛查 易感性 症状前 症状后 基线风险分析 生活方式改变 亚临床期行为干预 主动监测 个体化诊断 鉴别诊断 靶向治疗 药物作用监测 预后监测

分子检验技术与疾病 分子检验技术 – 基于核酸扩增 – 基于基因序列 应用 – 感染性疾病 – 遗传性疾病 – 肿瘤 – 药物基因组学 …… 3

核酸扩增分析技术的发展 4 光度法实时荧光 PCR 数字 PCR 基于核酸分子吸光度基于 Ct 值, 即检测到荧光 值对应的循环数 基于单分子 PCR 对核酸 定量计数 模板和目的片段不同： DNA 扩增技术 RNA 扩增技术

DNA 核酸扩增技术 5 在体外（试管中）特异地复制一段已知序列 DNA 片段的过程，从而获得大量 拷贝的特异核酸片段 循环 0 循环 1 循环 2 循环 3 循环 4 － 40 模板 DNA 变性和退火 延伸 3 个步骤为 1 个循环 1 个分子的模板 被复制成 2 个分子 每个分子为 下 1 循环的模板 反应产物量 以指数形式增长 经过 n 个循环 可得 2 n 个拷贝产物 变性和退火

RNA 扩增技术 以转录为基础核酸扩增技术 从互补靶核酸（ RNA ）合成 cDNA 以 cDNA 为模版进行转录 合成互补于靶序列的反义 RNA 以反义 RNA 为模板 重复循环扩增目的 RNA 6 RT RNA cDNA RT T7 RNA

RNA 扩增反应体系 基于核酸序列的扩增（ NASBA ） - 自主序列复制系统（ 3SR ） 反应体系涉及三种酶 AMVRT （鸟类成髓细胞白血病病毒逆转录酶） RNaseH T7RNA 聚合酶 基于转录介导的扩增（ TMA ） 反应体系涉及二种酶 MMRT （ money 鼠白血病病毒逆转录酶） 兼具有逆转录酶和 RNaseH 的活性 R7RNA 聚合酶 扩增分析 化学发光终点法 实时荧光核酸恒温扩增法（ SAT ）

核酸扩增产物分析技术 凝胶电泳分析 点杂交 荧光探针标记 微孔板夹心杂交 PCR-ELISA

凝胶电泳分析 方法 – 琼脂糖凝胶电泳 – 聚丙烯酰胺凝胶电泳 用途 – 扩增产物的大小 – 检测扩增情况 – 纯化扩增产物 项目 –Y 染色体微缺失 –apoE 基因型 –α 地中海贫血缺失型 –HLA 配型 ……

点杂交 特点 –DNA 固定到膜 – 杂交：非 / 放射性物质探针 – 分析：非放射性物质标记探针 – 分析核酸序列变异 多条带扩增产物 项目 α/ β 地中海贫血点突变 细胞色素 P450 2C19/2C9 酒精耐受基因 - 乙醛脱氢酶基因（ ALDH ） 亚甲基四氢叶酸还原酶（ MTHFR ）

实时荧光 PCR 在 PCR 反应体系中加入荧光基团 实时监测 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号 实现对起始模板的定量及定性分析

12 1. 定性 根据 CT 值，设定 CUTOFF 判定 2. 定量 利用已知起始拷贝数标准品绘制 标准曲线 检测未知样品的 Ct 值，通过标 准曲线计算该样品的起始拷贝数 CT 值越小，模板 DNA 的起始拷 贝数越多，反之 实时荧光 PCR C T 值

人乳头瘤病毒 (HPV) DNA 亚型 疾病 HPV 亚型 子宫颈癌 / 高度宫颈上皮 内瘤变 / 外生殖器癌 16 、 18 、 31 、 33 、 35 、 45 、 51 、 52 、 56 、 58 、 59 尖锐湿疣 6 、 11 、 16 、 18 、 31 、 33 、 34 、 35 、 39 、 51 、 、 70 、 73 疣状表皮发育不良 5 、 8 、 12 、 14 、 15 、 17 、 19 、 25 、 38 、 46 、 47 、 49 、 50 扁平疣 3 、 10 、 27 、 28 、 41 寻常疣 1 、 2 、 4 、 7 、 27 、 29 、 40 、 54 鲍温样丘疹病 16 、 18 、 39 、 42 低危 HPV 亚型型别和高危 HPV 亚型型别对皮肤相关疾病同等重要

RNA 扩增技术的应用 沙眼衣原体 (CT) 核酸 淋病奈瑟菌 (NG) 核酸 解脲脲原体 (UU) 核酸 EB 病毒核酸 肠道病毒 71 型 (EV71) 核酸 柯萨奇病毒 A16 型 (CA16) 核酸 CoxA16 、 EV71 特异性核酸阳性 手足口病确诊依据 潜伏期和发病初期即可检出

RNA 扩增技术与病原体检验  区分病原体的活性  起始靶标与扩增产物均为 RNA  病原体死亡， RNA 很快降解  判断 “ 活动性感染 ”  感染活动期： RNA 转录活跃  潜伏感染： RNA 不转录

数字 PCR 16 采用微流控或微滴化方法，将微量核酸溶液作大倍数稀释 使稀释后每个样品中所含有的待测分子数不超过 1 个 将所有样品在相同条件下进行 PCR ，对扩增后样品逐个进行计数 有核酸模板存在，其反应器会发出荧光信号；反之 根据相对比例和反应器的体积，推算出原溶液的核酸浓度 (copies/µl)

微滴生成技术使反应体系微室化 纳升级 独立反应体系 数字 PCR 一个反应体系 上万个独立反应微室  高灵敏度 微环境中富集目的片段，稀释背景序列，免受干扰 绝对定量分析 无需标准曲线，下限可低至单拷贝 不依赖 Ct 值

数字 PCR 稀有突变检测 低丰度病原微生物检测 微小差异基因表达分析 拷贝数变异分析 （ CNV ）

拷贝数变异（ CNV ）分析 由于基因组发生重排所致, 通常发生在 1kb 以上基因组大片段的拷贝数增加或者减少 表现为亚显微水平的缺失和重复 CNV 位点的突变率远高于 SNP CNV 现象广泛存在于癌细胞变异中 对于精度要求更高拷贝数分析 ( 例如区分 5/6 拷贝数变化 ) 数字 PCR 彰显优势

A broad array of Molecular Diagnostic platforms from PCR to NGS Sequencing Thermal Cycler QPCR NGS 分子诊断技术不断发展 定性 PCR 定量 PCR 一代测序 高通量测序 二代测序 三代测序

一代测序  传统的 Sanger 双脱氧链终止法 （Sanger Sequencing） 根据核苷酸在某一固定的点开始 随机在某一个特定的碱基处终止 在每个碱基后面进行荧光标记 产生以 A 、 T 、 C 、 G 结束的四组 不同长度的一系列核苷酸 聚丙烯酰胺平板电泳读取 DNA 碱基序列  高分辨率的毛细管电泳测序法 ( Sanger Sequencing and Fragment Analysis） 在 Sanger 法基础上 采用毛细管电泳技术读取 DNA 碱基序列 简便、快速、是主要的 DNA 测序技术

二代测序 (NGS) 合成测序法（ sequencing by synthesis ） 边合成边测序  在 Sanger 等测序方法的基础上，采用 不同颜色的荧光标记四种不同的 dNTP ， 通过聚合酶或连接酶不断地延伸引物获 得模板序列，最后对每一轮反应的结果 进行荧光图像采集、分析，获得序列结 果 大规模平行测序 更全面、更深入地分析基因组、转录组及 蛋白质之间交互作用组的各项数据 22

第三代测序技术 (NNGS) 采用电泳技术，借助电泳驱动单个分 子逐一通过纳米孔来实现测序。 由于纳米孔的直径非常细小，仅允许 单个核酸聚合物通过。 纳米级别的孔径保证了检测具有良好 的持续性，测序的准确度非常高。 无需进行扩增或标记就可以使用纳米 孔测序法进行检测 低成本、快速 23 新型纳米孔测序技术 nanopore sequencing

一代测序和高通量测序 一代测序 数量和 / 或结构异常 拷贝数变异（ Copy number variations ， CNVs ） 用于检测单个遗传病相关基因 高通量测序分析 (NGS) 用于检测目标基因和目标区域 (ASD/ID/DD Panel) 用于检测临床相关的外显子 (Clinical Exome) 用于整个外显子组研究 用于整个基因组研究

遗传相关疾病分子检测技术 染色体病  数量和 / 或结构异常  拷贝数变异 (CNVs) 单基因病 一对等位基因控制而发生 孟德尔规律, 称孟德尔遗传病 多基因病 表型由多个基因协同决定 数量性状遗传 多因子遗传 核型分析 FISH 多重连接探 针扩增技术 (MLPA) 比较基因组 杂交 (aCGH) 一代测序 高通量测序

线粒体耳聋 发病机理 – 线粒体 DNA 突变 10 多个突变位点与耳聋有关 主要是 mtDNAA1555G 、 A3243G 、 A7445G 三个位点 的突变 氨基糖甙类诱导耳聋的遗传基础 – mtDNA1555 、 7445 位点的突变 mtDNA A1555G 同质性突变患者听力损失以重度和 极重度为主 mtDNA A1555G 同质性突变患者听力损失以重度和 极重度为主 mtDNA A1555G 异质性突变患者听力损失以轻度和 中度为主 mtDNA A1555G 异质性突变患者听力损失以轻度和 中度为主

糖尿病  遗传因素  线粒体 DNA （ mtDNA ）突变是导致家族性糖尿病的重 要原因  线粒体 DNA 的突变 nt3243A→G 突变：最常见 在 tRNA Leu (UUR) 基因内发现超过 10 个与糖尿病 相关的突变位点 nt3252T→C 、 nt3250C→T 、 nt3256C→T 、 nt3260A→G 、 3316 G→A 突变

眼皮肤白化病（ OCA ） 亚型突变基因染色体定位发病率 OCA1 酪氨酸酶 (TYR) 11q14.31:40,000 OCA2 P 基因 (OCA2) 15q11.2-q121:36,000 OCA3 酪氨酸酶相关蛋白 1 (TYRP1)9p23 罕见 OCA4 膜相关转运蛋白 (MATP)5p13.3 罕见  OCA 各亚型间临床表现相似，具体分型需通过基因诊断确定  TYR, OCA2 基因诊断已应用于临床  TYRP1,MATP 的基因诊断还处于研究阶段

肿瘤 易感基因 诊断基因 靶向治疗相关的基因 29

肿瘤易感基因 由遗传决定的易于患某种或某类疾病的倾向性的基因 非组织标本类型的易感基因检测 –HPV 高危型：宫颈癌 –BRCA1/BRCA2 ：乳腺癌和卵巢癌 30

白血病融合基因 PML/RARα 融合基因及其变异型 – 颗粒型增多型 APL – 染色体 t （ 15;17 ）（ q22;q21 ）易位 BCR/ABL 融合基因 –Ph 染色体阳性的 CML – 即染色体 t （ 9;22 ）（ q34;q11 ）易位 – 已有靶向治疗药物 AML1-ETO 融合基因染色体 –AML-M2b 亚型 –21q22 的 AML1 基因与 8q22 的 ETO 基因融合 – 此类型预后较好 JAK2 V617F – 骨髓增殖性肿瘤（ PV 、 ET 和 PMF ） –JAK2 基因 14 外显子第 1849 位核苷酸 G 被 T 替代，导致第 617 位氨 基酸由缬氨酸（ V ）变为了苯丙氨酸（ F ） 31

肿瘤分子靶向治疗基因 EGFR 突变与吉非替尼治疗 – 吉非替尼是选择性 EGFR 络氨酸激酶抑制剂 – 作用靶点 外显子 19 缺失 外显子 21 点突变 – 耐药突变 外显子 20 （ T790M ） 32

33 基因检测内容相关肿瘤预测药物结果疗效 EGFR 扩增非小细胞肺 癌 食管癌 头颈部肿瘤 吉非替尼（易瑞沙） 厄罗替尼（特罗凯） 扩增好 外显子 18/19/21/22/20 （ S769I ） 突变好 外显子 20 （ T790M ）突变差 K-ras 密码子 12/13/61 肠癌 / 肺癌 / 胃癌 西妥昔单抗（爱比妥） 帕尼单抗（维克替比） 突变差 B-RAF V600E 位点突变突变差 PTEN 表达量高表达好 PIK3CA 8 号外显子 542 和 号外显子 1047 突变差 Her2/CE P17 扩增乳腺癌 / 胃癌曲妥珠单抗（贺赛汀）扩增好 C-kit 突 变 外显子 9 、 11 、 13 、 17 胃肠间质瘤伊马替尼（格列卫）突变好 ABL 酪氨酸激酶区点突变髓细胞白血 病 伊马替尼（格列卫）突变差 VEGF 表达量肠癌 / 肺癌 / 胃癌 / 乳腺癌 贝伐单抗（阿瓦斯丁） 索拉非尼, 恩度 高表达好

个体化用药 美国 FDA 要求用药前进行 EGFR 、 KRAS 等基因检测 将 EGFR 、 KRAS 、 ERCC1 、 RRM1 、 HER2 等基因检 测纳入到癌症治疗指南中 – 美国癌症综合治疗网络（ NCCN ） 34

药物基因组学 药物疗效和药物毒性个体化差异的筛查 –HBV DNA 突变 (YMDD 和阿德福韦酯） –EGFR 突变（易瑞沙） –CYP2C19 ( 氯吡格雷 ) –CYP2C9 的 *1 ， *2 ， *3 等位基因 VKORC1 基因 位点突变（华法林） –MTHFR （ C677T ）（叶酸） –ALDH2( 硝酸甘油 ) –UGT1A1( 依立替康 ) –TPMT （硫唑嘌呤） –HLA-B*1502 基因（卡马西平） –CYP2D6 、 CYP1A2 基因（精神类药物）

产前诊断 方法 – 二代测序 标本 – 孕妇外周血检测游离胎儿 DNA ，无创产筛 意义 –21- 三体综合征 ( 唐氏综合征 ) –18- 三体综合征 ( 爱德华氏综合征 –13- 三体综合征 ( 帕陶氏综合征 )

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