High Performance Liquid Chromatograph 理解 HPLC 的类型与模式的选择 理解 HPLC 主要部件的结构 掌握 HPLC 实验技术 掌握常用 HPLC 的使用及维护 学习目标学习目标

化学键合固定相的特点 （ 1 ）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快； （ 2 ）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击； 耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定； （ 4 ）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性； （ 5 ）有利于梯度洗脱；

凝胶色谱分离模型

分离类型选择

影响液相色谱分离的因素 液体的扩散系数仅为气体的万 分之一，则高效液相色谱速率 方程中的分子扩散项 B/U 较小 ，可以忽略不计，即： H = A + C u H-u 曲线 淋洗液黏度、极性、组成、流速、洗脱方式 固定相粒度、性质 柱温

液相色谱的流动相 1. 流动相特性 （ 1 ）流动相（淋洗液，洗脱剂）：组成改变，极性改变 ，可显著改变组分分离状况； （ 2 ）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极 性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正 相柱。 （ 3 ）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液 液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上 的出峰顺序相反。

2. 流动相类别 按流动相组成分：单组分和多组分； 按极性分：极性、弱极性、非极性； 按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。

3. 流动相选择 在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。 正相液 - 液分配分离：先选中等极性溶剂，若组分的保留时 间太短，降低溶剂极性，反之增加。 也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使 保留时间缩短。 常用溶剂的极性顺序： 水 ( 最大 ) > 甲酰胺 > 乙腈 > 甲醇 > 乙醇 > 丙醇 > 丙酮 > 二氧六环 > 四氢呋喃 > 甲乙酮 > 正丁醇 > 乙酸乙酯 > 乙醚 > 异丙醚 > 二氯甲烷 > 氯仿 > 溴乙烷 > 苯 > 四氯化碳 > 二硫化碳 > 环己烷 > 己烷 > 煤油 ( 最小 )

选择流动相时应注意的几个问题 （ 1 ）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累 积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。 （ 2 ）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏 柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定 相等。 （ 3 ）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉 淀并在柱中沉积。 （ 4 ）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外 检测器时，流动相不应有紫外吸收。

不管采用何种途径，配制流动相应用 新鲜水，水质越高放置时间越短。 理想的 HPLC 用水应为 18.2Ω 的超纯水， 并通过 0.22um 的滤膜，除去热源、有机 物、无机离子及空气等。

流速的选取

1 、对硅胶基键合相填科，水溶液流动 相的 pH 值不得超出 2—8. 5 的范围，温度 不宜过高。 2 、柱子在酸性或碱性条件下使用之后， 应依次用水、甲醇清洗. 3 、对暂时不用而需要较长时间保存的 柱子，要用纯甲醇清洗，柱子两端用金 属螺帽封闭，保存于干净的有机溶剂中。 使 用 与 维 护使 用 与 维 护

5 、要防止流动相逆向流动，否则将 使固定相层位移，柱效下降。 4 、要防止色谱柱被振动或撞击，否则 柱内填料床层产生裂缝和空隙，会使色 谱峰出现 “ 驼峰 ” 或 “ 对峰 ” 。

1 、除去柱上端固定相变色部分 ( 约 3mm 左右 ) ，再补充新的固定相。 2 、色谱柱吸附未被洗脱成分时，柱效 将明显下降，选合适的溶剂进行洗净。 可能提高柱效的方法 3 、采用梯度洗脱时，柱在重复使用前， 用泵把几倍于柱体积的起始溶剂压经柱子， 以重新建立起始的平衡来得到再生。

实验前准备工作 1 ．流动相溶剂的处理 2 ．试样溶液的制备

流动相溶剂的处理 (1) 水 将一般的蒸馏水，加入少许高锰酸钾， 在 pH9—10 的条件蒸馏，可用于常规洗 脱。 用于梯度洗脱的水，应进行二次蒸 馏。

(2) 有机溶剂的提纯 ◆用蒸馏法可除掉大部分有紫外吸收的杂质。 ◆氧化铝或硅胶柱可除去溶剂中的极性化合物。 ◆氯仿中（少量甲醇）先水洗，再蒸馏。 ◆四氢呋喃（抗氧剂丁基甲苯酚）而强烈吸收紫 外线，可蒸馏。 为了防止爆炸，蒸馏终止时，在蒸馏瓶中必 须剩余一定量的液体 。

(3) 溶剂的过滤和脱气 流动相溶剂在使用前必须先用 0.45ym 孔 径的滤膜过滤，以除去微小颗粒，防止 色谱柱堵塞。同时要进行脱气处理，因 为溶解在溶剂中的气体会在管道、输液 泵或检测池中以气泡形式逸出，影响正 常操作的进行。

样品处理技术 在某些试样中，常含有多量的蛋白质、脂 肪及糖类等物质。它们的存在，将影响组分 的分离测定，同时容易堵塞和污染色谱柱， 使柱效降低，所以常需对试样预处理。 样品的预处理方法：溶剂萃取、吸附、超速 离心及超过滤等。

1 ．溶剂萃取 溶剂萃取适用于待测组件为非极性物质。 在试样中加入缓冲溶液调节 pH ，然后用乙 醚或氯仿萃取待测组分。但如果待测组分 和蛋白质结合，在大多数情况下；难以用 萃取操作来进行分离。 2 ．吸附 将吸附剂直接加到试样中，或将吸附剂填充 于柱内进行吸附。亲水性物质用硅胶吸附， 而疏水性物质可用聚苯乙烯 — 二乙烯基苯等 类树脂吸附。

3 ．除蛋白质 向试样中加入三氯醋酸或丙酮、乙腈、甲 醇，蛋白质被沉淀下来，然后经超速离心， 吸取上层清液供分离测定用。 4 ．超过滤 用孔径为 l0 × 一 500 × l0 -10 m 的多孔膜过滤， 可除去蛋白质等高分子物质。

HPLC 的环境设置： HPLC 的日常操作条件：温度： 10 ～ 30 ℃；相对湿度 <80 ％； 最好是恒温、 恒湿，远离高电磁干扰、高振动设备， 有良好的通风设施。

HPLC 用水可以通过以下几个 方面来得到： 1 专门的纯水机或超纯水机； 2 去离子水重蒸； 3 二次或三次重蒸水； 4 采用类似家用的纯水机； 5 市场上瓶装的纯净水或蒸馏水； 6 其它途径；

HPLC 六通阀进样器的使用及 保养 六通阀进样器是高效液相色谱系统 中最理想的进样器，它是由圆形密封 垫 ( 转子 ) 和固定底座 ( 定子 ) 组成。美国 Rheodyne 公司的六通阀进样器最为 通用，各大 HPLC 仪器制造商均以此 产品作为仪器的进样器。

工作原理 手柄位进样 (Load) 位置时，样品经微量进样 针从进样孔注射进定量环，定量环充满后，多 余样品从放空孔排出； 将手柄转动至进样 (Inject) 位置时，阀与液相 流路接通，由泵输送的流动相冲洗定量环，推 动样品进入液相分析柱进行分析。

虽然六通阀进样器具有结构简单、使 用方便、寿命长、日常无需维修等特点， 但正确的使用和维护将能增加使用寿命， 保护周边设备，同时增加分析准确度。 如使用得当的话，六通阀进样器一般可 连续进样 3 万次而无需维修。

手柄处于 Load 和 Inject 之间时，由于暂时堵住 了流路，流路中压力骤增，再转到进样位，过高 的压力在柱头上引起损坏，所以应尽快转动阀， 不能停留在中途。在 HPLC 系统中使用的注射器 针头有别于气相色谱，是平头注射器。一方面， 针头外侧紧贴进样器密封管内侧，密封性能好， 不漏液，不引入空气；另一方面，也防止了针头 刺坏密封组件及定子。

六通阀进样器的进样方式有部分装液法和完 全装液法两种。使用部分装液法进样时，进样 量最多为定量环体积的 75 ％，如 20μl 的定量环 最多进样 15μl 的样品，并且要求每次进样体积 准确、相同；使用完全装液法进样时，进样量 最少为定量环体积的 3 至 5 倍，即 20μl 的定量环 最少进样 60 至 100μl 的样品，这样才能完全置换 样品定量环内残留的溶液，达到所要求的精密 度及重现性。推荐采用 100ul 的平头进样针配合 20ul 满环进样。

可根据进样体积的需要自已制作定量环，一般 不要求精确计算定量环的体积，譬如，一根名义 上 10μl 的定量环，实际是 9μl 还是 1lμl 并不重要， 因为被测样品和校正样品的进样体积保持一致， 在计算结果时误差都被抵消了。

进样样品要求无微粒和能阻死针头及进样阀的 物质，样品溶液均要用 0 ． 45μm 的滤膜过滤。防 止微粒阻塞进样阀和减少对进样阀的磨损。为防 止缓冲盐和其它残留物质留在进样系统中，每次 结束后应冲洗进样器，通常用不含盐的稀释剂、 水或不含盐的流动相冲洗，在进样阀的 Load 和 Inject 位置反复冲洗，再用无纤维纸擦净注射器 针头的外侧。

泵的保养： 使用流动相尽量要清洁； 进液处的砂芯过滤头要经常清洗； 流动相交换时要防止沉淀； 避免泵内堵塞或有气泡； 每次分析结束后，要反复冲洗进样口， 防止样品的交叉污染；

柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动； 当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干 净； 要注意流动相的脱气； 避免使用高粘度的溶剂作为流动相； 进样样品要提纯； 严格控制进样量； 每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品； 每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱； 若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封 闭； 柱的保养：

紫外灯的保养： 在分析前、柱平衡得差不多时，打开检 测器；在分析完成后，马上关闭检测器。 样品池要保养