第六章 植物脱病毒技术 第一节 植物脱病毒培养的意义 一、意义 1 、无性繁殖的植物在感染病毒病后，病毒可能在世代交替 中积累。 2 、真菌和细菌病害可医，病毒病无药可治。 3 、有性世代可以屏除病毒，但能引起后代的变异，如苹果， 马铃薯、月季等。 4 、一旦获得脱病毒植株，可以利用无性系快繁技术迅速扩 繁。 5 、脱病毒苗可以大幅度地提高经济植物的产量和品质。

二、脱病毒的含义 “ 无病毒 ” 植物一词使用相当粗放，不确切 1 、植物感染病毒后，再去除，称 “ 脱病毒 ” 苗更确切 2 、植物感染病毒可能是复合感染，脱病毒后，可以标明 去掉了哪些病毒。 第二节 脱病毒的途径 一、通过热处理消除病毒 1 、原理 ①在高于正常的温度下，植物组织中的许多病毒可以被部 分地或完全地 “ 钝化 ” ，但很少伤害甚至不伤害寄主植物。

植物生长区与热处理区关系图解。在热处理中， B-C 区是一个关键； 在寄主的热死点 C 和寄生物的热死点 B 之间的距离越大，热疗法成功 的机会也就越大。

2 、热处理方法 ①热水处理： 对休眠芽效果好。 ②热空气处理： 对活跃生长的茎尖效果好，既能消除病毒，又能使寄主植 物有较多的存活机会。 温箱处理：对马铃薯、甘薯类的块茎、块根进行处理，效 果好。 热处理室处理：对盆栽植物进行处理效果好。 热处理室中空气干热，容易发生 “ 红蜘蛛 ” 螨虫虫害，并注 意防蚜。 一般用内吸剂农药防治上述虫害的效果比较好。

热恒温处理： ℃， 4-6 周。 热变温处理： 40 ℃ 4 小时， 20 ℃ 20 小时，对寄主的健壮生长有利。 ③茎尖培养与热处理相结合： 效果最好。 注意： 并非所有的病毒都对热处理敏感，等径的和线性的 病毒对热处理敏感。 有时热处理过后的寄主对病害的抗性会降低，比对 照更易患病害。

二、小茎尖培养脱病毒 通行、有效的主流脱病毒技术 ( 一 ) 、脱病毒培养的原理 现在国际上一般都采用 “ 小茎尖培养 ” 进行脱病毒培养，原因可能 有： 1 、在一个植物体内，病毒易于通过维管系统而移动，但在分生 组织中，不存在维管系统。病毒在细胞间移动的另一个途径是 通过胞间连丝，但它的速度极慢，难以追上生长活跃的茎尖。 2 、在旺盛分裂的分生细胞中，代谢活性很高，使得病毒无法复 制。 3 、倘若在植物体内确实存在 “ 病毒钝化系统 ” 的话，它在分生组 织中应比在任何其他区域都有更高的活性，因而分生组织不受 侵染 4 、在茎尖中存在高水平的内源激素，可以抑制病毒的增殖。

（二）外植体 茎尖生长点带 1-2 个叶原基的小茎尖， mm 大小。 （三）接种及培养方法 1 、接种及解剖用具：解剖针，尖锐有弹性。 虹膜刀，小，锋利。实体显微镜，表面消毒。 2 、消毒、接种 消毒液复合使用 70% 酒精， 30 秒左右； 0.1% 的 HgCl2 ， 8-10 分钟； 或饱和漂白粉（ 10% 左右）. 无菌条件下剥取茎尖接种于培养基上。

带一个生长点和一对叶原基的小茎尖

草莓小茎尖培养接种一个月后的生长状况

（四）在茎尖培养中影响脱毒效果的因素 1 、培养基 基础培养基可以选用 MS 培养基，附加生长素、细胞激动 素，茎尖一般会按原来的发育方向发展，加入激素促进其 快速发育。 一般固体培养较好； 液体培养（如滤纸桥法）可以减少愈伤组织的形成。 2 、外植体的大小 过小，生长缓慢；过大脱病毒不彻底；叶原基内含有内源 激素，因此带叶原基往往被保留比较好。 3 、培养条件 25±2 ℃， 1000lux ， 12 小时黑暗和光照交替进行。

4 、外植体的生理状态 活跃生长的芽比休眠芽好，顶芽比侧芽好。 5 、热疗方法 小茎尖培养加热处理，效果更好。 6 、化学疗法 利用抗病毒制剂，加入到培养基中。 放线菌素 -D ，放线菌酮能抑制原生质体中的病毒。

二、花药培养脱病毒 1 、脱病毒原因： 花粉母细胞减数分裂旺盛，无病毒。花粉粒雄核发育后形成 的再生苗应该是脱病毒苗。 2 、存在问题： 单倍化，脱病毒检验。

三、愈伤组织培养法脱病毒 在由受感染的组织形成的愈伤组织中，并非所有的细 胞都均匀一致地带有病毒。在受到 TMV 侵染的烟草愈 伤组织中，只有 40% 的细胞受到侵染。 1 、脱毒原因： ①病毒的复制速度赶不上细胞的增殖速度， ②有些细胞通过突变获得了抗病毒特性， ③抗病毒侵染的细胞可能与敏感细胞一直存在于母体 植株的组织中。 2 、存在的问题：愈伤组织的再生能力和再生植株的变 异

五、脱毒效果的检验 （一）检验的意义、目的 小茎尖培养并不能 100% 的脱掉病毒。 （二）检验的方法： 1 、目测法检验：一年要多次检测。 2 、指示植物检测 指示植物：蔓陀萝、洋酸浆、苋色黎。 ①石英砂接种：取待检植物的叶片，冲洗干净后 放入研钵，加 600 号石英砂和等体积的 0.1mol/L Na 3 PO 4 （缓冲液），研磨后进行摩擦 接种检测。 ②蚜虫接种检测

③小叶嫁接法检测 野生东方草莓为鉴定寄主， 如 EMK ， UC4 ， UC5 等。 接种后 天可以存活， 3-4 周可进行调查。

3 、血清学鉴定 鸡冠血、兔耳血 快速、准确、效率高、鉴定量大。 4 、电子显微镜鉴定 梯度离心，采取特定病毒沉积层，透射电子显微镜 观察。 六、脱病毒原种的保存 脱病毒植株可以再次感染病毒。 病毒的主要传毒媒介是蚜虫。 在繁殖原种和生产上使用的种苗时，要防蚜。

1 、网室防蚜 采用尼龙纱网防蚜，尼龙纱网 目。 网室内定期喷药杀虫。 2 、土壤消毒 对于土壤传播的病毒如 TMV 等，应进行土壤消毒。 可以采用福尔马林熏蒸土壤。 注意残毒和药害。 3 、割除地上部器官 对于马铃薯这样的以地下贮存器官或营养器官作为繁殖器官 的，可以在结合蚜虫预报，割除地上器官，防止蚜虫传染病 毒。

七、脱病毒苗的优缺点 一般由于脱毒苗消除了病毒对植株的影响和抑制，所以 生长旺盛，产量和品质会得到改善。 但有些脱病毒苗，易感染强系病毒或病菌，造成更大的 危害。 如:如: 马铃薯脱掉 PVX 病毒后，对镰孢菌造成的干腐病的敏感 性比相应的受 PVX 感染的马铃薯要强。日本曾经由于该 原因造成干腐病流行。 病毒交叉保护现象：一种病毒的存在可以使寄主植物有 能力抵抗另一种病毒的侵染的现象。该现象已经受到广 泛的重视