座位顺序 ( 临床 106 预防 49) 讲台 1排1排 2排2排 3排3排 4排4排 5排5排 6排6排 7排7排 01 ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ 70 8排8排 71 ～

免疫学实验 A 废弃物品投到固定容器 在实验室内必须穿白大褂 在实验室内不许吃喝 课后把台面打扫干净、器材洗刷干净 试管、烧杯、滴管 等带细菌的物品 不带血和细 菌的废物 来苏尔 血液物品应在过 氧乙酸中消毒

实验内容 一． 一． 实验动物保护固定技术 二． 二． 常用动物免疫接种方法 三． 三． 小鼠免疫器官的认识 四． 四． 小鼠免疫细胞的分离与计数

实验动物 实验动物是指以用于科学研究或生物学测试为 目的、定向培育、多年来所育成的动物。特点是 遗传学背景清楚，性状稳定，体内外微生物学、 寄生虫学带染有严格要求和界定，具有科学实验 所需要的某些生物学特点并在环境设施、饲料营 养等方面有特殊要求以保证其优良的质量。迄今 为止只有几种啮齿类动物能达到这个标准，即最 常用的小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠。

根据遗传学性状，实验动物可以分为三类，即近交系动物、 封闭群动物、杂交群动物。近交系动物需要至少 20 代同胞或 亲子交配，实验时结果稳定，重复性强，但后代退化，繁殖、 生长、抗病力都受到影响，也会影响实验数据；封闭群动物 是将两群近交系动物在封闭环境中杂交，也可产生遗传型和 表型都较一致的群体；为了进一步发挥杂交优势，利用两种 不同品系的杂交 1 代作为试验载体称为杂交群动物，生命力更 强，对环境更适应，繁殖力、抗病力、寿命相对较强，在生 命科学研究领域中用量最大。

根据微生物学控制要求可将实验动物分为 4 个等 级，即普通动物 ( 只存在正常菌群 ) 、无特定病原体动 物 ( 不存在对试验干扰较大的某些病原体 ) 、悉生动物 ( 体内只带有少数已知的病原体 ) 、无菌动物 ( 体内不 存在细菌 ) 。

一．实验动物保护固定技术 抓取固定时既要小心仔细，不能粗暴，又要大胆敏捷。 小鼠温顺，一般不会咬人，抓取时先用右手抓取鼠尾提 起，置于鼠笼上向后拉，在其向前爬行时，用左手拇指和食 指抓住小鼠的两耳和颈部皮肤，将鼠体置于左手心中，以小 指和无名指夹住鼠尾。该方法能进行灌胃、皮下、肌肉和腹 腔注射等操作。

（二）大鼠的抓取固定方法 基本同小鼠，抓取时为避免咬伤，可带上帆布手套。 （三）蛙类的抓取固定方法 用左手将动物背部贴紧手掌固定，以中指、无名指、 小指压住其左腹侧和后肢，拇指和食指分别压住左、右前 肢、右手进行操作。在抓取蟾蜍时，注意勿挤压其两侧耳 部突起之毒腺，以免毒液射进眼中。 实验如需长时间观察，可破坏其脑脊髓或麻醉后用大 头针固定在蛙板上。 耳后毒腺

（四）豚鼠的抓取固定方法 豚鼠较为胆小易惊，不宜强烈刺激和受惊，所以在抓 取时，必须稳、准和迅速。先用手掌迅速扣住鼠背，抓住 其肩胛上方，以拇指和食指环握颈部，另一只手托住臀部。

（五）兔的抓取固定方法 抓取：实验家兔多数饲养在笼内，所以抓取较为方便， 一般以右手抓住兔颈部的毛皮提起，然后左手托其臀部或 腹部，让其体重大部分集中在左手上。 1 、 2 、 3 均为不正确的抓 取方法（ 1 ．可损伤两肾， 2 ．可造成皮下出血， 3 ．可伤两耳）， 4 、 5 为 正确的抓取方法。颈后部 的皮厚可以抓，并用手托 兔体。

固定：一般将家兔的固定分为盒式、台式和马蹄形三种。 盒式固定，适用于兔耳采血、耳血管注射、肛温测量等情况； 若做血压测量、呼吸等实验和手术时，则需将兔固定在兔台上， 四肢用粗棉绳活结绑住，拉直四肢，将绳绑在兔台四周的固定 木块上，头以固定夹固定或用一根粗棉绳挑过兔门齿绑在兔台 铁柱上；马蹄形固定多用于腰背部，尤其是颅脑部位的实验， 固定时先剪去两侧眼眶下部的毛皮，暴露颧骨突起，调节固定 器两端钉形金属棒，使其正好嵌在突起下方的凹处。 盒式固定台式固定马蹄形固定

（六）狗的固定方法 首先绑住狗嘴 — 驯服的狗绑嘴时可从侧面靠近轻轻抚摸 其颈背部皮毛，用布带迅速兜住狗的下颌，绕到上颌打一个 结，再绕回下颌下打第二结，然后将布带引至头后颈项部打 第三个结，并多系一个活结（以备麻醉后解脱）。如实验需 要静脉麻醉时，可先使动物麻醉后再解去绑嘴带，把动物放 在实验台上，然后先固定头部，再固定四肢。

二、常用动物免疫接种方法 灌胃 腹腔注射 尾静脉注射 皮内注射 皮下注射 肌肉注射

灌胃 小鼠专用灌胃针由注射器和喂管 组成，喂管长约 1nm ，喂管尖端 焊有一金属小圆球，金属球中空， 用途是防止喂管插入时造成损伤。 金属球弯成 20 度角，以适应口腔 与食道之间弯曲。 将喂管插头紧紧连接在注射器的接口上，吸入定量的药液；左 手捉住小鼠，右手拿起准备好的注射器。将喂管针头尖端防放 进小鼠口咽部，顺咽后壁轻轻往下推，喂管会顺着食管滑入小 鼠的胃，插入深度约 3cm 。用中指与拇指捏住针筒，食指按着 针竿的头慢慢往下压，即可将注射器忠的药液灌入小鼠的胃中。 在插入过程中如遇到阻力或可看见 1/3 的针管，则江喂管取出重 新插入，因为这时灌胃并没有插入胃中。

腹腔注射 左手提起并固定小鼠，使鼠腹部 朝上，鼠头略低于尾部，右手持 注射器将针头在下腹部靠近腹白 线的两恻进行穿刺，针头刺入皮 肤后进针 3nm 左右，接着使注射 针头与皮肤呈 45° 角刺入腹肌， 穿过腹肌进入腹膜腔，当针尖穿过腹肌进入腹膜腔后抵抗感 消失。固定针头，保持针尖不动，回抽针栓，如无回血、肠 液和尿液后即可注射药液。注射量为 ml/10g 体重。

尾静脉注射 置尾巴于 ℃温水中浸泡几分钟或 用 75% 酒精棉球反复擦拭尾部, 以达到 消毒和使尾部血管扩张及软化表皮角 质的目的. 行尾部静脉注射时, 以左手拇 指和食指捏住鼠尾两恻, 使静脉更为充 盈, 用中指从下面托起尾巴, 以无名指夹 住尾巴的末梢, 右手持注射器使针头与 静脉平行，从尾巴的下 1/4 处进针, 开 始注入药物时应缓慢, 如果无阻力, 无 白色皮丘出现, 说明已刺入血管, 可正式 注入药物. 有的实验需连日反复尾静脉 注射给药, 注射部位应尽可能从尾端开 始, 按次序向尾根部移动, 更换血管位置 注射给药。注射量为 ml/10g 体 重。拔出针头后，用拇指按住注射部 位轻压 1-2min ，防止出血。 小鼠尾部动 静脉分布， 动脉为红色， 静脉为紫色

皮下注射 将药液推入皮下结缔组织，经毛 细血管、淋巴管吸收进入血液循 环的过程。作皮下注射常选项背 或大腿内侧的皮肤。 操作时，常规消毒注射部位皮肤，然后将皮肤提起，注射针 头取一钝角角度刺入皮下，把针头轻轻向左右摆动，易摆动 则表示已刺入皮下，再轻轻抽吸，如无回血，可缓慢地将药 物注入皮下。拔针时左手拇、食指捏住进针部位片刻，以防 止药物外漏。注射量约为 ml/10g 体重。

皮内注射 将药液注入皮肤的表皮和真皮之 间，观察皮肤血管的通透性变化 或皮内反应，接种、过敏实验等 一般作皮内注射。 先将注射部位的被毛剪掉，局部常规消毒，左手拇指和食指 按住皮肤使之绷紧，在两指之间，用结核菌素注射器连接 4.5 针头穿刺，针头进入皮肤浅层，再向上挑起并梢刺入，将药 液注入皮内。注射后皮肤出现一白色小皮丘，而皮肤上的毛 孔极为明显。注射量为 0.1ml/ 次。

肌肉注射 小鼠体积小，肌肉少，很少采用 肌肉注射。当给小鼠注射不溶于 水而混悬于油或其他溶剂中的药 物时，采用肌肉注射。操作时 1 人固定小鼠，另一人用左手抓住 小鼠的 1 条后肢，右手拿注射器。 将注射器与半腱肌呈 90° 角迅速 插入 1/4 ，注入药液。用药量不超 过 0.1ml/10g 体重。

三、小鼠免疫器官的认识 甲状腺 气管 胸腺 心脏 肺脏 肾脏 食管

小鼠淋巴结 派氏节

唾液腺 肋骨 横膈 肝脏 肠道 睾丸及附睾 尿道球腺

四、小鼠免疫细胞的分离与计数 将小鼠脾脏用弯头镊子捣碎后徐徐加至 2mL 将小鼠脾脏用弯头镊子捣碎后徐徐加至 2mL 淋巴细 表层 ( 以小组为单位 ) 胞分离液表层 ( 以小组为单位 ) 2000rpm×20min ，取 1 台显微镜 (202 室 ) 和 1 把加样器 (204 室 ) 2000rpm×20min ，取 1 台显微镜 (202 室 ) 和 1 把加样器 (204 室 ) 吸取乳白色淋巴细胞 + 生理盐水 (saline) 洗涤 吸取乳白色淋巴细胞 + 生理盐水 (saline) 洗涤 1100rpm×5min 1100rpm×5min 去上清，加 mL 生理盐水重悬 去上清，加 mL 生理盐水重悬 取该细胞悬液 10  L+30  L 台盼蓝染液混匀 取该细胞悬液 10  L+30  L 台盼蓝染液混匀 取 10  L 悬液加于计数板，高倍镜计活淋巴细胞数 ( 非蓝染细胞 ) 取 10  L 悬液加于计数板，高倍镜计活淋巴细胞数 ( 非蓝染细胞 ) 配成 2×10 7 个 /mL 细胞悬液 配成 2×10 7 个 /mL 细胞悬液

注意事项 1. 先后用酒精和擦镜纸将盖玻片擦干净，放在细 胞计数板上； 2. 将显微镜的光圈调小，光线调暗； 3. 在低倍镜 (10×) 下找到 25 格孔，再换高倍镜 (40×) 计数； 4. 计数结束后再擦干净计数板。

每毫升细胞数： N= （ N1+N2+N3+N4+N5 ） ×5 ×10 4 ×4 N1 N2 N3 N4 N5 N=6

下课前班长安排 7 次下午实验课的值 日生，负责清洁地面； 上午的实验课主要是观察和分析实验 结果，书写实验报告，当堂交实验报告； 下午课开始前班长带人去 204 室取回 批好的实验报告并发给同学； 每组选 1 名组长，负责取和还显微镜 和加样器，每次取还都要登记； 班长将实验指导和实验记录的费用 （每人 7 元）交给嘉 3 的刘静老师，电话 。